免疫检测的自动化及标准化PPT课件

.,1,免疫检测的自动化及标准化,蚌医一附院检验科王凤超,.,2,免疫分析技术,经典的免疫分析技术凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合实验特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实现自动化。现代的免疫分析技术荧光免疫标记、放射性免疫标记、酶免疫标记、镧系（稀土）元素免疫标记、临床化学免疫分析技术、发光免疫标记、流式免疫微球技术及生物传感器技术等。特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。,.,3,荧光免疫标记技术,1950年Coons合成异硫氰酸盐(荧光染料)，用作标记抗体做小鼠组织切片染色，开创了免疫荧光技术（immunofluorescencetechniques）,又称为荧光抗体技术（Fluorescentantibody）传统免疫荧光技术：荧光显微镜下分析荧光状态、分布，及流式细胞仪，荧光偏振分析现代免疫荧光技术：荧光激活细胞分类仪（FACS)，荧光自动化分析测试仪、时间分辨荧光技术（TRF)TRF：以稀土离子(镧系元素）标记抗原或抗体，稀土原子具有荧光发射峰谱范围窄、激发光波长范围宽的特点，有利于增强荧光的特异性，提高分辨率；排除非特异性荧光的干扰、降低本底荧光。具有标记物制备简便、有效期长、不污染环境、操作流程短、标准曲线线性范围宽，高灵敏、高特异、有效期长、易于实现自动化、应用范围广等优点。,.,4,放射性免疫标记技术,1958年，美国科学家贝尔森和雅洛把放射性“标记”引入免疫分析，两人也因此获得了1977年的诺贝尔生理学奖。早期的研究都是以I131(射线和射线)作为标记的，目前用的是高纯度、高活性的I125(弱射线)，以减少放射性核素对人体健康潜在的影响。优点：高灵敏、高特异缺点：同位素半衰期及污染问题、试剂有效期短、反应时间长、批间批内的差异、标准曲线稳定性差、不易实现自动化。从90年代开始放免分析在国际上每年以10的速度下降。随着时间的推移，将会被新的技术方法取代。,.,5,磁微粒分离技术,2-3um的超顺磁性磁微粒作为实现免疫反应结合物与反应混合物的分离载体其核心制造技术是在超顺磁性磁微粒的表面大量偶联了特异性结合抗体参加反应后的免疫磁微粒通过一个外加磁场吸附下来，然后把其它杂质去掉免疫反应在反应状态上，相比微孔板式的固相反应(固液界面反应)优化成了准液相反应，反应面积、几率大大增加，其反应速度大大加快。制备的试剂具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、结果准确可靠的优点动力粒子:,.,6,酶免疫标记技术,酶免疫标记技术,酶免疫测定,酶免疫组化技术,均相酶免疫测定,异相酶免疫测定,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定（ELISA）,.,7,酶免疫分析的自动化,酶免分析系统的标准化，自动化与网络化，是全实验室自动化（TotalLaboratoryAutomation，TLA)系统的重要组成部分，包括样本(前处理)模块、酶免分析(后处理)模块、软件信息模块等，是迈向全面实验自动化建设的重要基石。,.,8,酶免疫分析的自动化,样本处理自动化主动标本识别条码阅读功能；更高的标本处理效率;更少的劳动强度;职业暴露机会最小化；通过减少人为失误、改善加样精度与准确性来改善分析质量，采用批量（batch)或随机(randomaccess)进行多种组合与多种模式的检测全自动酶免分析系统多任务、多通道，完全实现平行过程处理，特别是自由任务资源管理系统，可以随时增加(急诊)任务菜单，实现最优反应过程(实验质量)和最大化分析生产力(throughput)。根据处理模式的不同，全自动酶免分析系统可分为两类，即一体机:如EVOLIS.Alisei.Tecan，PersonalLAB，变色龙等;分体机:如AT和费米；斯达尔和费米;RSP和MPP3000等。,.,9,MicrolabATplus2增强型全自动样本处理机,采用主动条码识别12通道加样针主动抛弃式加样头容积从10一300ul96个标本加样速度小于5分钟可批量处理最多5块微板。,.,10,FAME(费米)全自动酶免分析系统,硬件上采用综合模块化设计，并行工作模式、双孵育双洗板、单读数模块可容纳10块板，24个试剂位，30个密闭式孵育位采用液体水平探测(LLD)、体积与重量传感、光学位置传感等技术，实现了真正的全过程控制(TPC)，尤其是专利的洗液传感器，确保了最佳洗板效果。软件上采用全自动GMP/GLP规范系统，如全面的系统跟踪记录（Traceability）与系统追溯（Traceability），标本试剂加样校验(Sarnpleverification)及“自由任务管理”等功能。,.,11,哈美顿的辉煌之星酶免之星,.,12,TECAN大型全自动酶免一体机,采用条码识别和试管架定位两种标本识别模式，可调式四维方式运动传输加样头则使用一次性加样头与TEFLON钢针任意组合加样速度高达1956孔/小时，试剂分配速度为7680孔/小时可同时在线20项试验，每块板内分别进行12项试验。恒温孵育器多达2个，每个孵育器至少可容纳6个板读板速度达6秒/板，4种洗液在线模式，清洗液量系统监控试剂全开放,.,13,BRIO开放式全自动酶免系统,中心处理系统为双试剂和样本盘模式，可容纳4块微孔板，120样本，最大运行9项测试。测试模式可为随机插入式或成批处理式。双机连机型加样速度达768标本h，试剂分配速度为2300孔h孵育及振荡模式均采用独立控制的孵育及振荡位，温度范围25-45C，具有1C增量和/或1300rpm振荡。原采血试管、试剂、缓冲液、清洁液，废液瓶均配有液面自动检测系统。缺点是读数器（酶标仪）独立于机外。,.,14,Alisei全自动酶免分析系统,中心处理系统采用独特的滑轮传送模式，内含六块微孔板具有双针加样系统，共配有4个高精度的注射器，加样速度达700标本/h，试剂分配速度为1900孔/h系统利用多批次处理方式，每天可处理20块微孔板的不同项目测试，同时在线16个不同项目。独立的孵育振荡位多达6个，试剂开放具有时间优化管理功能,.,15,PersonalLAB全自动酶免分析系统,可同时处理两块酶标板最多运行6种不同项目192个检测机械手臂能够根据样本具体情况，选择使用金属针或者一次性的塑料加样头，加样速度小于14分钟(96个样本)，试剂分配速度小于3分钟(96孔)系统拥有两个独立的封闭式温育仓，一个清洗站和两个读数平台，专利的洗板头为8个加液器和8个吸液器组成探针的内外双冲洗可最大限度地减少交叉污染。,.,16,NexgenFour全自动酶免分析系统,双臂四针，可并行运行4块96孔酶标板系统由1个中央样品装载盘，2套独立三维加样臂、4个独立孵育舱、48通道读数器、2套洗板装置组成。拥有可实时互换的双重加样针(金属加样针和一次性加样头)，并行加样本速度800孔/h，加试剂速度3800孔/h。该仪器由内、外2套计算机管理，先进的运行软件基干WINDOWSXP和NET架构设计。仪器还可以增选全自动过敏原分析装置。,.,17,EVOLIS全自动酶免分析系统,EVOLIS是一个全面开放的全自动酶免系统，内置多种模式的条形码解读功能，用户可任意设置或修改ELISA试验涉及到的所有参数。可同时处理四块酶联反应微孔板，每板多达12种测试,同时上样180个标本;系统配置八个滤光片同时对多块板进行不同组合的操作样品和试剂加样针采用一次性加样头具有液面及血凝/气泡感应检测器；4个独立的孵育盘，3种不同的洗液，灵活多变的微孔板清洗方式,.,18,变色龙开放式全自动酶免系统,变色龙是一套全自动、开放式，连续、多批次酶免分析系统。高度灵活的加样功能，可在加样针中进行稀释，加样速度9分钟/96孔，加试剂速度为2.5分钟/96孔，可放置188个样品管和预稀释管120个加样用Tips头、8个预稀释液56个对照或标准品。一次性Tip头和固定加样针自由互选，独有的微孔交叉吸液使残留液减至2ul以下。独立的温控板位多达4个，可进行独有的振荡式加盖孵育。,.,19,小结,目前，部分全自动酶免分析系统已具备全过程控制（TPC）系统，符合GMP，GLP硬件和软件规范，可以全自动生成实验操作记录(Traceability)和系统追溯记录(Trackability)，这些技术进步不仅有助于建立信息化的质量控制(QC)和质量保障(QA）体系，而且在医疗责任举证倒置的实践中，这些记录或证据将可以阐明酶免实验的正确性和可靠性，以防患各种纠纷的产生。,.,20,化学发光免疫测定,.,21,化学发光免疫测定的分类,1发光酶免疫测定（间接化学发光）,AP/OHHPO42,光,.,22,化学发光免疫测定的分类,2直接化学发光,+光,.,23,化学发光免疫测定的分类,3电化学发光,.,24,电化学发光,反应原理:化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价，这是一种强氧化剂,TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA十.，它很不稳定，可自发地失去1个质子(H十)，形成自由基TPA.，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的Ru(bpy)33+使其形成激发态的Ru(bpy)32+，。激发态的三联吡啶钌很快发射出一个波长620nm的光子，回复成基态的三联吡啶钌。这一过程可以在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。,基态,激发态,.,25,美国雅培公司的AXSYM全自动快速酶免疫分析系统,技术原理：MEIA、FPIA、ICIA标记物：碱性磷酸酶包被技术：微粒子包被分离技术：纤维网分离发光剂：4MUP发光诱导：酶催化底物发光检测方法：夹心法和竞争法检测速度：70Th试剂位：20灵敏度：1015重复性：批内5，批间10,.,26,美国雅培公司的I2000SR,技术原理：化学发光标记物：吖啶酯包被技术：磁微粒子包被分离技术：磁性分离发光剂：吖啶酯发光诱导：改变PH值检测方法：夹心法和竞争法检测速度：200Th试剂位：25灵敏度：1015重复性：批内5，批间10,.,27,美国拜耳CS180SE和ACSCENTAUR全自动化学发光免疫分析系统,技术原理：化学发光标记物：吖啶酯包被技术：磁微粒子包被分离技术：磁性分离发光剂：吖啶酯发光诱导：改变PH值检测方法：夹心法和竞争法检测速度：100Th试剂位：13灵敏度：1015重复性：批内5，批间10,.,28,德国全自动化学发光免疫分析仪LIAISON,技术原理：直接化学发光技术标记物：异鲁米诺包被技术：磁微粒子包被分离技术：磁性分离发光剂：异鲁米诺发光诱导：改变PH值检测方法：夹心法和竞争法检测速度：180Th试剂位：15灵敏度：1015重复性：批内5，批间10,.,29,VitrosECI全自动增强化学发光酶免分析仪系统,技术原理：增强化学发光技术标记物：辣根过氧化物酶标记包被技术：链霉亲和素包被的子弹头型塑料小孔管为固相载体包被分离技术：直接清洗分离发光剂：鲁米诺发光诱导：酶催化底物发光检测方法：夹心法和竞争法检测速度：70Th试剂位：15灵敏度：1015重复性：批内5，批间10,.,30,Access2全自动微粒子酶放大化学发光免疫分析系统,技术原理：间接化学发光标记物：碱性磷酸酶包被技术：磁微粒子包被分离技术：磁性分离发光剂：AMPPD（Dioxetane)发光诱导：酶催化底物发光检测方法：夹心法和竞争法检测速度：80Th试剂位：24灵敏度：1015重复性：批内5，批间10,.,31,UniCelDxI800免疫分析系统,真正24小时待机，50个试剂储存于仪器自备冷藏系统中，每小时400个实验,自动稀释、重检、样本检测项目的随机组合，急诊标本具有优先权力仪器前部具备一次性上机120个原始管能力，运行状态中可不断循环加入,仪器背部预留自动化轨道进样模式的加样能力分立的4个进样系统、一体化的整系统检测方式,共享一个检测系统和孵育器、共享一套冲洗、读数系统、使用同一个光量子探测器、共享一个定标和QC结果,.,32,美国DPC公司Immulite2000型全自动酶放大化学发光免疫分析系统,技术原理：间接化学发光标记物：碱性磷酸酶包被技术：塑料珠包被分离技术：离心分离发光剂：AMPPD（Dioxetane)发光诱导：酶催化底物发光检测方法：夹心法和竞争法检测速度：120Th试剂位：24灵敏度：1015重复性：批内5，批间10,.,33,ELECSYS1010和ELECSY2010型全自动电化学发光免疫分析系统,技术原理：电化学发光标记物：Ru(bpy)32+包被技术：磁微粒子包被分离技术：磁性分离发光剂：Ru(bpy)32+发光诱导：酶催化底物发光检测方法：夹心法和竞争法检测速度：85Th试剂位：18灵敏度：1015、1018重复性：批内5，批间10,.,34,电化学发光,电化学发光免疫测定(ECLIA)是继放射免疫、酶联免疫、荧光免疫，化学发光免疫以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光和免疫测定相结合的产物。电化学发光标记物发光的原理与一般化学发光不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。它包括电化学和化学发光两个过程。ECLIA的优点:是灵敏度高，测定速度快、线性范围宽、结果稳定、自动化程度高、试剂保存期长，应用范围广等。,.,35,E170,模块化170Th其它同2010,.,36,法国梅里埃公司的VIDAS全自动荧光酶标免疫测试系统,该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，用塑料吸管(SPR)为固相载体，以4一甲基伞型酮磷酸盐（4一MUP）为发光剂，它被酶标抗体上的碱性磷酸酶分解，脱磷酸形成4一甲基伞型酣，经37Onm激光照射下，发出450nm的荧光，经荧光读数仪记录，并计算出所测物质的含量。,AP,H3PO4+,360nm激发光,4-MU,4-MUP,.,37,美国Wallac公司的DELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统,该系统用镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物,并与时间分辨荧光测定技术(TRFIA)相结合，建立了一种新的非放射性微量分析技术，具有灵敏度高，示踪物发光稳定，不受样品自然荧光干扰，标准曲线范围宽，检测重复性好等优点。,.,38,免疫检测自动化分析的特点,快速灵敏稳定减少误差及差错的发生,.,39,免疫检测的标准化,.,40,主要仪器设备,加样器加样系统洗板机酶标仪全自动检测系统,.,41,酶标仪-酶标仪的使用,1.测定波长波长范围：400nm750或800nm常用波长：450nm和492nm目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶（HRP），底物通常为四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）双波长比色：应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片2.测定的吸光度范围通常：在02.5之间即可以满足ELISA的测定要求：对于酶标仪的吸光度范围不必去刻意追求大的吸光度范围，主要要看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何,.,42,酶标仪-酶标仪的自检和校准,1.酶标仪的线性选用540nm波长,将标称值0.5,1.0A中性滤光片分别放入专用测试板样本位置中,以空气为参比,各重复测定3次;然后将以上两片中性滤光片叠加后置于专用测试板的同一孔位中,重复测定3次.线性误差2.测定速度的检定选用492nm波长，放入96孔酶标板进行测定，用秒表计测仪器的打印出全部数据的时间。,.,43,酶标仪-酶标仪的自检和校准,3.通道差检测取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑、透明、无划痕、无污染）以酶标板架作载体，分别加入三种不同浓度的甲基橙溶液200ul先后置于8个通道的相应位置，蒸馏水调零，采用双波长（测定波长490nm，参比波长630或650nm，以下均相同）连续测三次，观察其不同通道之间测量结果的一致性可用极差值来表示其通道差。4.孔间差的测量选择同一厂家、同一批号酶标板条（8条共96孔）分别加入200ul甲基橙溶液（吸光度调至0.0650.070A）先后置于同一通道，蒸馏水调零，采用双波长检测，其误差大小用1.96s衡量。,.,44,酶标仪双波长问题,双波长测定：由于标本中干扰组份的存在以及小孔杯本身质量等原因，常常导致测定结果的假性增高，而酶标仪提供的双波长测定功能则可以消除干扰组份或因素对测定结果的影响。对于标本中干扰组份的清除，在选择参比波长时，我们应对于扰组份的光谱进行研究，以正确选择参比波长；而对于小孔杯本身质量问题等干扰因素的消除，只要选择远离测定波长的参比波长即可以了，这对保证测定结果的准确性是非常重要的。,.,45,洗板机注意事项,1.有一定的洗涤次数多次洗涤有利于取得好的效果，一般不超过6次。2.注意每孔的加液量以加满为宜，但不可溢出，一般为每孔300微升3.建议在洗涤前进行位置调节，吸针要到微孔底部，以降低残留量。4.建议用户采用两点吸液与底部冲洗方式，以得到好的洗涤效果。5.每天使用后用双蒸水冲洗管路。6.定期维护、检修仪器及配件。,.,46,加样器-加样器的类型,单道连续可调式移液器多通道连续可调式移液器单道连续移液器单道移液管配合使用的移液器,.,47,加样器-加样器的使用,.,48,加样器-加样器的校准,校准环境和用具要求：室温：2025，测定中波动范围不大于0.5。电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。称量时，为保证天平内的湿度（相对湿度60-90%），天平内应放置一装有10ml蒸馏水的小烧杯。小烧杯：510ml体积。测定液体：温度为2025的去气双蒸水。选定校准体积：加样器标定体积的中间体积；最小可调体积（不小于拟校准体积的10%）。拟校准体积；如为固定体积加样器，则只有一种校准体积。,.,49,加样器-加样器的校准,校准步骤：将加样器调至拟校准体积，选择合适的吸头；调节好天平；来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头垂直握住加样器，将吸头浸入液面23mm处，缓慢（13秒）一致地吸取蒸馏水；将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体；将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一档，等待13秒，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出；记录称量值；擦干吸头外面；按上述步骤称量10次；取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按附表所列蒸馏水Z因子计算体积。按校准结果调节加样器。,.,50,加样器注意事项,根据所需取液量选择相应的移液器及吸头吸取液体时应缓慢匀速吸取，避免液体回吸。在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。连续可调式移液器不可在无吸头时使用，吸头有液体时不可平放或倒置。操作时要慢和稳，吸嘴浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变；改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸嘴；发现吸嘴内有残液时必须更换；新吸嘴使用前应先预测。,.,51,全自动检测系统校准,温育系统校准加样系统校准工作程序的优化,.,52,免疫测定的数据处理及结果报告,.,53,定性？定量？,定性测定常以“有”或“无”也即“阳性”或“阴性”来表达测定结果；半定量测定虽介于定性和定量之间，但从严格意义上来说，其仍属于定性测定，只不过其对定性测定中的“阳性”作了进一步的分级，即所谓的强阳性阳性弱阳性的区别定量测定的结果则以浓度（如IU/L、ug/L等）的方式表达。,.,54,定性测定结果确定的依据,定性测定结果确定的依据在于阳性阴性判定值（Cut-off）的建立，Cut-off值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现。除了Cut-off值以外，还有许多其它的设值方法以判断阴性和阳性结果，如S/N（常称为P/N）比值（Ratio）等。,.,55,定量测定结果的依据,系列浓度标准品测得的剂量反应曲线，即通