生物技术在园林植物遗传育种改良上的

生物技术在园林植物遗传育种改良上的应用,教师:李懿,植物原生质体培养与细胞融合,一、概念原生质体：被去掉细胞壁的具有生活力的裸露细胞。原生质体培养：将去掉了细胞壁的裸露细胞培养成植株的技术。原生质体融合（细胞融合、体细胞杂交）：将不同种、甚至属间细胞人工融合为杂种细胞，并使其再生成植株的技术。,二、原生质体培养与细胞融合的方法步骤1原生质体的制备获得大量有活力的原生质体。机械分离法酶解分离法：分离材料的准备（离体叶片、悬浮细胞等）酶解（果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）,2）原生质体的收集与纯化过滤离心法（沉淀法）漂浮法界面法,2原生质体的培养培养原生质体的基本营养同一般组培；对某些组分，如钙和碳源的水平要求更为严格。在培养基中保持一定的渗透压极为重要。常用的培养基有：MS培养基、N-T培养基、B5培养基等。培养方法：固体培养法；浅层液体培养法；双层培养法,3细胞融合1）原生质体融合PEG法、电融合法、高pH高浓度钙离子法、NaNO3法等；,2）杂种细胞的筛选突变细胞遗传互补选择法营养互补选择法,3）体细胞杂种植株的鉴定形态学方法、细胞学方法，分子标记法等。融合体的类型：对称融合非对称融合,三、原生质体操作在育种中的应用培育新品种创造新种质克服远缘杂交不亲和、杂交不育等障碍作为基因工程的良好受体进行突变体筛选的优良原始材料,植物基因工程,一、植物基因工程的概念及其研究概况植物基因工程是指按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的DNA片段，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因，引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。,1972年，构建第一个重组DNA分子。1983年，世界上获得首例转基因植物。1985年，创建叶盘法进行植物的遗传转化。,观赏植物基因工程的目的基因,1、观赏性开花、花色、花型、花径相关基因。2、抗逆性抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因3、切花寿命4、花期调控,二、植物基因工程的一般程序与方法,1目的基因的分离与克隆PCR技术基因组相减技术cDNA差异显示技术等,2植物表达载体的构建1）启动子的选择组成型启动子：35S特异性启动子：组织特异性、诱导特异性2）终止子3）选择标记基因：npt-II、hpt、bar等,报告基因(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合,报告基因的种类新霉素磷酸转移酶（NeomycinephosphotransferaseII,NPTII)基因氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基因潮霉素磷酸转移酶（Hygromycinphosphotransferase,Hpt）基因葡萄糖酸苷酶（Glucuronidase,GUS）基因荧光素酶（Luceferase,Luc）基因抗除草剂（Basta,Bar）基因,质粒图谱及质粒构建启动子外源基因终止子启动子报告基因终止子（标记基因）目的片段选择标记载体,3植物的遗传转化1）农杆菌介导法2）基因枪法3）花粉管通道法4）其他方法：PEG法、电激法、显微注射法、激光法、脂质体法、超声波法、真空浸润法、碳硅纤维介导法,1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法,含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体，与含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。,Ti质粒的结构T-DNA区Vir区Con区Ori区,Vir区,E,TiPlasmid,T-DNA区,Ori区,Con区,农杆菌介导的转化质粒的构建,PG2TNOS,AmprPG1T,Vir区,2、基因枪介导的转基因操作,3、PEG诱导的基因转化,聚乙二醇（PEG）、多聚鸟苷酸、磷酸钙在高PH值条件下诱导原生质体捕获DNA分子。,步骤：共保温；稀释PEG；非选择培养；选择培养。,优点：转化顺利，对细胞伤害小；避免嵌合体的生成；易于选择；便于进行理论研究；受体广泛。,4、脂质体介导,用化学物质将DNA包裹成球体，通过植物原生质体的吞噬作用，把DNA导入细胞。,5、电激法介导,利用高压脉冲作用，在原生质体上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。,四、转基因植物的鉴定,遗传鉴定表达鉴定表型分析鉴定,利用报告基因Northern杂交Western杂交,直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。1）扩增目的片段；2）杂交信号鉴定。（Southern杂交）,SouthernDNA印迹杂交,植物遗传转化流程,适宜外植体的选择及再生体系的建立,抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择,遗传转化操作,载体介导的转化方法DNA直接导入法种质系统法,选择培养,转基因植株鉴定,获得再生植株,转化质粒的构建,转基因植株的繁殖与应用,利用报告基因Southern杂交Northern杂交Western杂交,五、基因工程的安全性,（一）安全问题的考虑工程菌株的处理转基因植物的释放转基因产品的安全,1.转基因作物本身成为杂草；2.转基因作物使其亲缘野生种成为杂草或超级杂草；3.转基因作物可能产生新的病毒或疾病；4.转基因作物对非目标生物的危险；5.转基因作物作为外来种对新生境的入侵，使生物多样性受到威胁；6.转基因作物对生态系统及生态过程的影响；7.其它一些不可预计的风险。,（二）转基因植物的风险,（三）生物安全的管理,法国为对遗传修饰生物体(GMO)的评价和立法成立了两个专门委员会。第一个是遗传工程委员会，成立于1975年，任务集中于实验室的重组DNA的研究；1986年又成立了生物分子工程委员会，它的任务是评价遗传修饰生物体的大田试验、释放以及商品化过程的安全问题。,进入90年代特别是1992年联合国环境与发展大会的召开，更加促进了国际上对生物安全立法工作的重视，特别是大会由许多国家签署的两个纲领性文件21世纪议程和生物多样性公约均在有关条款中提到了生物技术安全问题。,1993年，在原国家科学技术委员会领导下成立了国家生物遗传工程安全委员会，由来自卫生部、