分光光度法测定叶绿素含量

1、 实验目的1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。二、实验原理叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯比尔定律计算出提取液中各色素的含量。叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。三、仪器、原料和试剂仪器分光光度计、电子顶载天平(感量001g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦境纸、滴管。原料新鲜(或烘干)的植物叶片试剂1. 96乙醇(或80丙酮) 2. 石英砂3. 碳酸钙粉四、操作步骤取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置35min。取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL，摇匀。取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm 和652nm 下测定吸光度，以95乙醇为空白对照。五、计算按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素a、b 和总叶绿素的含量叶绿素a= （12.7 A665 -2.69 A645） 叶绿素b=（12.7 A645 - 2.69A665） 总叶绿素a=（20.0A645 + 8.02 A665 ） 或总叶绿素a= 几种叶绿素含量测定方法比较叶绿素含量是植物生长过程中一个重要的生理指标,由于其对周围环境很敏感,并与植物的光合作用、营养吸收等密切相关,被广泛作为植物生长的常规测定指标项目。叶绿素含量的测定方法有多种,在国际上以传统的Arnon法(也称研磨法)应用最为广泛。但该法需要把植物材料研磨并经转移、过滤或离心处理,不仅工作量大,而且不可避免地使试验人员较长时间与挥发于空气中的试剂相接触,对人体损害较大。近年来,直接浸取法受到重视,张宪政等用不同配比的混合液对叶绿素进行提取,证明了用混合液提取的可行性。李得孝,吴志旭等对传统的Arnon法进行了改进,将样品冷冻处理后,用50丙酮静置提取并进行测定,极大提高了工作效率。(1)研磨法。称取0. 5 g样品于研钵内,加入少量CaCO3和5 mL 80%的丙酮,将材料充分研磨细碎直至变白(约5 min),转移至10 mL具塞离心管中,定容至刻度,摇匀后置于4冰箱中静置12 h,离心10 min (2000 r/min),取上清液测定。(2)直接浸取法。称取0. 5 g样品放入10 mL具塞离心管中,用80%丙酮定容至刻度,于暗柜中静置72 h浸取,取上清液测定。(3)样品冷冻后用50提取液提取法。称取0. 5 g样品于10 mL具塞离心管中,置冰箱中冷冻2h,取出后加入10mL在水浴锅中加热至50的80%丙酮,充分振摇后于暗柜中静置4h,取上清液测定。（4）叶绿素计法：叶绿素计是所有方法中最快捷的，你只需手持叶绿素计，将叶片插入仪器的感应部位，然后合上测量探头即可。应用于这种测定的仪器又被叫做便携式叶绿素仪，因为该叶绿素计拥有小巧的机身，仅200g的重量，可以方便地装入口袋并带到现场进行测量。在以上几种测定方法中，直接浸取法提取效果最好,但耗时长,传统研磨法叶绿素的损失较大,冷冻后用50提取液提取法操作简便且提取速度较快,在提取率和稳定性方面均显示良好的优越性。冷冻后用50提取液提取法的最优试验条件为将试验材料冷冻1 h后,静置提取3 h。而叶绿素仪法，则相较于其他三种化学方法，更加快速方便。而且用SPAD-502测定叶绿素含量时，不会对叶片造成损伤，这也是使用叶绿素计的另一大好处。因为你不需要摘下叶片，直接用仪器夹住叶片测定即可，这样就可以在作物的生长过程中全程对特定的叶片进行监测，从而得到更科学的分析结果。分光光度法快速测定玉米叶片中的叶绿素作者:作者：潘玲玲 徐晓洁 谭晶晶 张海艳 乔英哲 张晔晖 来源：医学期刊 / 基础医学与生物医学工程收藏本文章【关键词】 叶绿素,SPAD值,玉米叶,分光光度法摘要 以玉米叶片为材料，利用双波长双光束紫外可见分光光度计，用最大决定系数增量回归算法，研究了叶片叶绿素a、b及SPAD值同时、快速测量方法。结果表明，用3个波长点建立的模型可以达到良好的预测效果，预测叶绿素a、b及SPAD值的相关系数分别为0.9919、0.9816和0.9757；标准差分别为1.52、0.43和1.96；预测相对标准差分别为4.64%、5.50%和4.88%。同时研究了仪器波长误差和带宽变化对测定结果的影响, 发现波长偏移超过0.2 nm,误差快速增大，且波长向长波方向偏移时对测量的影响要大于向短波方向偏移的影响；仪器带宽变大，预测误差也就越大。关键词 叶绿素，SPAD值,玉米叶，分光光度法1 引言 叶绿素a、叶绿素b的含量的测定一般用光谱方法。先用某种溶剂（如丙酮等）提取叶绿素，然后用光谱仪器测定1,2，这类方法操作繁琐，耗时太长。而活体叶片中叶绿素的测量一般只能测定叶绿素总量或SPAD(soil and plant analyzer development)值3。同时测定叶绿素a、叶绿素b和SPAD值的方法，尚未见报道。本研究以玉米叶片为材料，利用双波长双光束紫外可见分光光度计，用最大决定系数增量回归算法，研究了叶片叶绿素a、叶绿素b及SPAD值同时、快速测量方法；研究了仪器波长误差和带宽变化对测定结果的影响。 本研究既可作为实验室快速测量的方法，也为开发研制野外活体叶片快速、无损测定仪器提供了参考。 2 实验部分2.1 仪器与试剂557型紫外可见分光光度计（日本日立公司）；60片玉米叶片，SPAD值用SPAD502测量仪测定；叶绿素a、叶绿素b含量用Arnon法测定。2.2 实验方法在分光光度计上，用双波长方式，参比波长为750 nm；扫描区间为590 700 nm，分别在带宽为2、4、6、8、10 nm测量60片玉米叶片的吸收光谱。测得的光谱图经过实验室自主开发的光谱数字化系统，每隔0.1 nm采集一个数据，得到数字化的光谱图。 3 结果与讨论3.1 叶片的吸收光谱图图1是带宽为2 nm时的光谱，吸收峰值约680 nm，噪声很小，其它带宽下测得的图谱也类似。3.2 数学模型的建立 在590700 nm的波长范围，每隔1nm取一个吸光值，用最大决定系数增量回归算法来建立模型。选出叶片叶绿素a、叶绿素b和SPAD值同时测定的最优波长，即选择预测相对标准误差最小的波长组合。结果表明：当只选择一个波长时，是625 nm；选择两个波长点时，最优组合是635和625 nm；选择个波长点时，最优组合是635、625和610 nm；选择个波长点时，最优组合是635、625、610和655 nm；选择5个波长点时，最优组合是635、625、610、655和700 nm；选择6个波长点时，最优组合是635、625、610、655、700和595 nm。图2是以上6种组合时各种物质的预测相对标准差。 图1 60片玉米叶片吸收光谱图（略）Fig.1 bsorption spectra of 60 maize leaves 图2 不同波长数目的预测效果（略）Fig.2 rediction (RSD) of the models with different wavelength number从图2中可以看出，所用波长数越多，测量效果越好。但这种变化越来越缓慢，尤其是3个波长以后，随着波长数目增加，测量效果改善不显著。此外，叶绿素b的测量效果不如叶绿素a的测量效果好，而SPAD值的测量效果不同波长的差异不大；可能是叶绿素b的含量较低，化学值测量的相对误差较大；而SPAD值本身是用一个波长的吸收而得，所以较容易准确测定；总体上，当选个波长点组合，种组分测定的相对标准差约5%，如图3和图4所示。 图3 叶绿素a（）和叶绿素b（B)预测集的散点图（略）Fig.3 Diagram of the prediction result of chlorophyll a (A) and chlorophyl b (B) 图4 SPAD预测集的散点图（略）Fig.4 Diagram of the prediction result of Soil and Plant Analyzer Development (SPAD)图3A和B以及图4分别是叶绿素a、叶绿素b和SPAD值测量时选择波长635 nm、625 nm以及610nm组合建立模型的预测效果图。这时叶绿素a、叶绿素b和SPAD值测量的预测相关系数分别是09919、0.9816和0.9757；预测标准差分别是1.52、043和1.96；预测相对标准差分别是4.64%、550%和4.88%；满足叶片分析测量的要求。 3.3 仪器波长误差对测量的影响研究用635、625和610 nm 3个波长所建立的模型，当测定样品时仪器波长发生偏移对测量结果的影响。当波长偏移0.1 nm、0.2 nm、0.5 nm、1 nm时引起的相应测量误差如图5所示。从图中可以看到，波长偏差0.1 nm，0.2 nm，叶绿素a、叶绿素b的RSD 值变化将近到达50%，对SPAD值测量的影响虽不如叶绿素a、叶绿素b明显，但是当波长偏移超过0.2 nm时，影响也很大，所以叶绿素的测量对仪器的波长准确性要求很高。3.4 仪器带宽变化对测量的影响利用带宽6 nm这组光谱数据，用635、625以及610 nm 个波长建立的模型，预测在仪器带宽为2、4、8、10 nm下测量的相应样品，结果如图6所示。从图中可以看到预测2、4 nm带宽样品的误差较小，但预测8和10 nm带宽样品的误差很大，且带宽的变化，对叶绿素a、叶绿素b的影响要大于对SPAD值的影响。说明当仪器带宽变大时会引起较大的测量误差，而仪器带宽变小时，对测量影响不大。 图5 波长变化对测量的影响（略）Fig. Prediction RSD of the models with these wavelengths changing图 6 nm带宽下建立的模型用于其它带宽的测量结果（略）Fig. rediction RSD of the models at 6 nm with bandwidth changingReferences1 Peng Yunsheng(彭运生), Wang Huaqi(王化琪), He Daogeng(何道根). Spectroscopy and Spectral Analysis(光谱学与光谱分析), 1998, 18(3): 2692722 Arnon D I Plant Physiol, 1949， 24： 1153 Ji Haiyan(吉海彦), Yan Yanlu(严衍禄)， Feng Xuemei(冯雪梅)， Wang Linghui(王灵慧). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)，1993, 21(8)： 869872（中国农业大学信电学院，北京 100094） （北京农学院，北京 102206)甘肃农科院外源腐胺对干旱胁迫下小麦叶片渗透调节的影响来源：中国农学通报.-2009，25(09).-148-151作者：赵文才等阅读次数：122干旱胁迫诱导植物叶片气孔关闭、萎蔫，降低叶绿素和蛋白质含量、改变细胞膜的结构和功能、增加活性氧的含量。在水分胁迫下，矿质元素的吸收能力下降，因此，在渗透调节中起主要作用的可能是小分子有机物，如可溶性糖和脯氨酸等。许多研究表明，干旱胁迫下，小麦叶中脯氨酸、可溶性糖等有机溶质增加，参与降低植株体内的渗透压。多胺(polyamine，PA)是一类广泛存在于原核生物和真核生物中的生物活性物质，是一类低分子脂肪族含氮碱。近年来，国内外学者开始研究多胺在延长植物衰老、提高植物抗逆性等方面的作用机理，而对干旱胁迫下多胺与植物渗透调节物质关系的研究还未见相关报道。因此，笔者研究源腐胺对干旱胁迫下冬小麦叶片丙二醛含量、质膜透性、游离氨基酸含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量的影响，旨在探讨腐胺提高冬小麦抗旱性的机理，为干旱区栽培和育种提供理论依据。1材料与方法11材料试验于2007年9月2008年5月在河南农业大学资源与环境学院人工气候室内进行，供试材料为冬小麦(Triticum aestivum)品种洛早6号。种子经10次氯酸钠消毒、蒸馏水冲洗、室温吸涨12h后，于25恒温箱中萌发24h，选露白一致的种子用Hoagland营养液在(251)恒温室盆钵中进行水培，每天光照12h，光强4400lx。待小麦幼苗四叶一心时，选取长势一致的幼苗，进行试验处理。12试验设计试验设3个处理：CK：Hoagland；T1：Hoagland+15PEG-6000；T2：Hoagland+15PEG6000+100molLPut；重复3次。在处理后0、1、2、4、8、24、36、48h，取小麦叶片用于各项指标测定。13方法131丙二醛MDA含量测定：按赵世杰的方法测定。132质膜透性测定：膜相对透性按李锦树等的方法测定。133游离脯氨酸(Pro)含量测定：用酸性茚三酮法测定。134游离氨基酸总量(TIA)测定：按邹琦的茚三酮法测定。135可溶性糖(SS)测定：葸酮比色法测定。14数据统计分析2. 试验数据采用Excel、DPS软件进行统计分析2结果与分析21外源腐胺对干旱胁迫下冬小麦叶片丙二醛(A)含量的影响由表1（略）可知，正常条件下(CK)，冬小麦叶片MDA含量变化不大，干旱胁迫处理(T1)和干旱结合外源腐胺的处理(T2)的MDA含量均显著高于对照平(POO1)。干旱胁迫处理(T1)使冬小麦叶片MDA含量变化呈急剧上升趋势，胁迫24h达到最高为2874molg FW，与1h时相比，增加了的557，达到极显著水平(PO01)，是处理(CK)的495倍。而100molL腐胺的处理(T2)中，冬小麦叶片MDA含量随胁迫时间延长呈缓慢上升的趋势，但MDA含量显著低于处理(T1)，在24h达到最低，仅为干旱胁迫处理(T1)的18。22外源腐胺对干旱胁迫下冬小麦幼苗叶片质膜透性(P)的影响由表1(略)可以看出，在正常供水条件下(CK)，冬小麦幼苗叶片的PMP变幅很小，维持在13左右。干旱胁迫条件下，叶片的PMP都高于对照，其中干旱胁迫处理(T1)，随着胁迫时间的延长，叶片的PMP显著增加，48h达到最高，为41257，是对照的299倍，达到极显著水平(PO01)。结合外源腐胺的处理(T2)，叶片的PMP在胁迫后4h最高，比对照提高34，达到显著水平(PO05)，胁迫后36h，叶片的PMP最低，仅为干旱处理(T1)的l55。说明外源腐胺显著抑制了冬小麦幼苗叶片质膜透性的增加。23外源腐胺对干旱胁迫下冬小麦叶片中可溶性糖(SS)含量的影响可溶性糖含量的增加被普遍看作是植物对水分胁迫的种适应机制。试验结果表明(表2)，与对照相比，干旱胁迫各处理的可溶性糖含量均显著增加(P005)。胁迫4h，干旱处理(T1)可溶性糖含量达到2713mgg，与CK相比提高33，达到极显著水平(PO01)，4h后，干旱处理的缓慢下降，但仍高于对照；结合外源腐胺处理(T2)，可溶性糖含量逐渐上升，在48h达到2978mgg，是处理(T1)的173倍，达显著水平(P005)。24外源腐胺对干旱胁迫下冬小麦叶片脯氨酸(Pro)含量的影响脯氨酸的积累是对水分胁迫的一种适应。从表2（略）可知，正常处理(CK)条件下，小麦叶片中Pro含量约为1030gg，干旱胁迫下(T1)，冬小麦幼苗叶片的Pro含量在lh时，达到50546gg，是对照的307倍，达显著水平(P005)，此后，随着胁迫时间的延长，Pro含量迅速降低，48h时最低为16155g，仅为对照的58。处理(T2)，冬小麦幼苗叶片的Pro含量与对照相比显著提高(P0O1)，胁迫后8h达到212562gg，是对照的l626倍，干旱胁迫处理(T1)的95倍。表明外源腐胺可通过提高冬小麦叶片中Pro含量，降低渗透势，缓解干旱对冬小麦的伤害，同时也表明，干旱胁迫条件下叶片脯氨酸含量可以作为抗旱性指标。25外源腐胺对干旱胁迫下冬小麦叶片中游离氨基酸(TFA)含量的影响正常条件下，冬小麦幼苗叶片中TFA的含量维持在较低的水平(表2略)。干旱胁迫下(T1)，冬小麦幼苗叶片游离氨基酸含量显著增加。胁迫后1h，叶片中TFA的含量是对照的178倍，胁迫后24h，叶片中TFA的含量与对照相比，增加了115，达极显著水平(P0O1)。外源腐胺处理(T2)，干旱胁迫4h后，叶片中TFA的含量是对照的178倍，胁迫后24h，叶片中TFA的含量与对照相比，增加了115，达极显著水平(P0O1)。外源腐胺处理(T2)，干旱胁迫4h后，叶片中TFA的含量与对照相比极显著增加(P001)，是对照的279倍：胁迫8h后，Pro/FA为01789。这表明，干旱胁迫下，叶片脯氨酸含量占的比例越大，冬小麦抵御干旱的能力越强，外源腐胺处理显著提高了脯氨酸所占的比例，提高了冬小麦的抗旱性。26干旱胁迫下冬小麦幼苗叶片有机渗透调节物质与丙二醛(MDA)含量及质膜透性(PMP)的相关性由表3（略）可见，处理(CK)的MDA含量与可溶性糖、脯氨酸和游离氨基酸含量为正相关关系，干旱处理(T1)的MDA含量与游离氨基酸和可溶性糖含量呈正相关关系，而脯氨酸含量与MDA含量呈负相关关系，且达到显著水平。干旱结合外源腐胺处理(T2)的MDA含量与脯氨酸含量为正相关关系，且相关性达到显著水平，而与可溶性糖含量呈正相关关系。而对PMP来说，处理(CK)的PMP与可溶性糖含量为正相关关系，而与脯氨酸、游离氨基酸的含量呈负相关。干旱处理(T1)的PMP与脯氨酸、游离氨基酸含量呈显著负相关关系，而与可溶性糖含量呈正相关关系，但未达到显著水平。结合外源腐胺的干旱处理(T2)的PMP与可溶性糖、脯氨酸含量为负相关关系，且相关性不显著，而与游离氨基酸含量呈正相关关系。3讨论干旱胁迫打破了植物体内活性氧产生和清除的平衡，造成活性氧的积累，而作为膜脂过氧化产物的MDA能损伤细胞膜的结构和功能，直接导致质膜透性升高。干旱胁迫处理的MDA含量从处理的第4小时开始均极显著高于对照，最高分别达对照的495倍，PMP从处理的第1小时开始均极显著高于对照，最高分别达对照的299倍。说明干旱胁迫处理引发了小麦幼苗的膜脂过氧化作用。同时，胁迫后1-2h，冬小麦幼苗叶片可溶性糖、游离氨基酸、脯氨酸含量分别是对照的133，177，307倍，相关性分析表明，干旱胁迫处理的脯氨酸含量与MDA含量呈显著负相关关系(P001)，这说明，干旱胁迫前期，冬小麦感受干旱信号，通过应激反应提高渗透调节物质含量，降低叶片细胞水势，缓解干旱对冬小麦的伤害。但渗透调节作用有一定的局限性，随着胁迫环境的延续，会使植物体渗透调节能力降低或丧失。笔者也证明了这一点，胁迫4h后，干旱胁迫超过了伤害阈值，导致膜脂中不饱和脂肪酸被氧化，膜的完整性受到破坏，从而使小麦叶片受到伤害。许多研究表明，外源多胺缓解干旱胁迫下作物叶片膜脂过氧化和提高作物抗旱性。笔者认为，外源腐胺处理，叶片的PMP在胁迫后4h最高，比对照提高34，胁迫36h后，叶片的PMP最低，仅为干旱处理(T1)的155，达到显著水平(P005)。说明外源腐胺显著抑制了冬小麦幼苗叶片质膜透性的增加，这与段辉国的研究一致。同时，外源腐胺处理，无论是SS、Pro还是TFA，在干旱胁迫48h内，均明显增加其中干旱胁迫后8h，SS、Pro还是ProTFA分别是干旱胁迫处理的135、951、1064倍。外源腐胺可以通过诱导可溶性糖、游离氨基酸、脯氨酸含量增加，提高冬小麦叶片脯氨酸含量所占的比例，降低渗透势。这可能是腐胺提高作物抗旱性的又一途径。外源腐胺对小麦根中盐胁迫引起的氧化损伤的保护作用 在线阅读整本下载分章下载分页下载 本系统暂不支持迅雷或FlashGet等下载工具【英文题名】The Protection of Exogenous Putrescine to the Oxidative Damage Induced by Salt Stress in Wheat Roots【作者】马瑛;【导师】毕玉蓉;【学位授予单位】兰州大学;【学科专业名称】植物学【学位年度】2008【论文级别】硕士【网络出版投稿人】兰州大学【网络出版投稿时间】2008-10-31【关键词】腐胺; 抗氧化酶; 脯氨酸; H_2O_2; NaCl;【英文关键词】antioxidant enzymes; H_2O_2; NaCl; proline; putrescine;【中文摘要】盐胁迫是限制农作物产量的主要原因之一,多胺在植物对逆境胁迫的响应过程中起重要作用。本文以小