植物的原生质体培养ppt课件

原生质体培养，植物原生质体培养，主要内容，原生质体培养的概念，原生质体培养的优越性，分离的原生质体培养，原生质体：指细胞壁被除去的细胞或被质膜包围的裸球形细胞。细胞、微丝、叶绿体、线粒体、质膜、液泡、细胞核、内质网、微管、细胞壁、高尔基体、植物细胞模式图，细胞壁由三种主要成分纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%组成。1。植物原生质体的特征：1。吸收能力增强：容易吸收外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等。易于吸收氧气和营养物质；2.全能性：具有一套完整的遗传材料，并具有细胞壁再生和人工培养分化为完整植株的能力；3.原生质体融合可以在一定条件下诱导形成杂交细胞。4.分泌能力的增加：消除了细胞壁的扩散障碍，增强了细胞膜的通透性，促进了胞内产物的分泌。5.稳定性差的：失去细胞壁的保护作用，稳定性差的：易受渗透压等条件变化的影响。原生质体的应用，原生质体培养的意义，(1)为细胞融合奠定基础。有性杂交不允许细胞质交流。(2)是基因工程的理想受体。可以直接摄取外来的DNA、细胞器甚至微生物。(3)理论研究。细胞壁再生，细胞膜离子转运，病毒感染。因为细胞壁不仅具有保护功能，而且还参与细胞生长和分化等生命活动。然而，必须指出的是，原生质体在继续发育之前必须再生细胞壁。原生质体制备不同的植物细胞由于细胞壁成分、结构和性质不同，原生质体制备方法也不同。1.原生质体分离的材料准备：选择有活力的细胞和嫩组织。无菌试管苗的叶上胚轴和子叶细胞(愈伤组织)的培养。2.原生质的分离。1)机械方法：尖刀机械切割。2)酶法：果胶酶和纤维素酶处理。1)1892年，机械方法首次用于藻类分离原生质体。细胞壁首先被分离，然后用刀子切割，使原生质流出或释放。该方法可以避免酶制剂对原生质体的损伤。缺点：1)手工操作困难，原生质体产量低，费时费力，大规模制备困难。2)能够通过这种方法产生原生质体的植物种类有限。(2)酶水解。1960年，英国诺丁汉大学的科金首次使用酶水解法从番茄幼苗的根尖制备了大量原生质体。常用酶：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、蜗牛酶等。优点：条件温和，原生质体完整性好，活力高，产量高，几乎所有的植物或其器官、组织或细胞都可以通过酶解获得原生质体。缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶和酚类，它们会影响获得的原生质体的活性。在酶处理之前，通常将供体组织置于具有适当浓度的压力稳定溶液中，并且在酶处理之前将细胞前质壁分离大约一小时，然后用酶溶液处理。原因是前质壁的分离可以充分暴露细胞壁的内表层，增加细胞壁降解酶与细胞壁的接触面积，提高细胞壁降解速度。减少原生质体中电解质的渗漏，防止分离过程中外源酶被吸入细胞，降低原生质体对酶溶液中可能有害作用的敏感性，提高原生质体的稳定性和存活率。嘿。酶溶剂和渗透压酶型酶溶剂：原生质体培养基或特殊制剂，酸碱度。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶解时间：酶浓度和温度。(2)酶的考虑，酶的类型和浓度。对于幼叶，纤维素酶的酶浓度较低：0.5%-1%的纤维素酶和0.2%-0.5%的果胶酶；纤维素酶和果胶酶在愈伤组织和悬浮细胞中的浓度应在酶量较小时提高到1%或2%。酶量大，酶液的酸碱度为5.4-5.8，因为酸碱度高，酶活低；低酸碱度，原生质体损伤。酶液渗透压，裸露的原生质体必须保持在一定的渗透压下，以免破裂，也不会因过度收缩而破坏内部结构。因此，必须在酶溶液中加入渗透压稳定剂来代替细胞壁保护原生质体。常见的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。目前，主要使用甘露醇或山梨醇，其可以稳定地保持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8摩尔/升.然而，蔗糖不常用，因为它容易被原生质体吸收和利用，并降低渗透浓度。另外，在酶液中加入葡聚糖硫酸钾、氯化钙等盐类，保护细胞膜，提高原生质体的稳定性和活力，酶水解处理的条件较轻：一般在黑暗中静止进行。温度：25，原生质体和酶都有活性；时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体活动，一般为24小时。例如，对烟叶进行酶处理2小时后，叶肉细胞被解离。(3)原生质体分离过程：一步法(以烟叶为例)，第一步：预处理，即限制烟草植株供水；第二步：取常规的嫩叶表面，灭菌，在无菌条件下去皮，切成4厘米的小块；第三步：配制混合酶液(纤维素酶2%，果胶酶0.5%)，加入0.7摩尔甘露醇0.1摩尔氯化钙5.6；第四步：将小块烟叶放入混合酶溶液中，在25处理8-10小时；第五步：过滤、离心和洗涤(0.7摩尔)获得2-3次原生质体，并说明原生质体分离的过程(以叶片为例)。原生质体从愈伤组织中分离出来。原生质是从叶子中分离出来的。原生质体的收集和纯化：酶解后得到的混合溶液包括原生质体、细胞团和组织碎片等。在继续培养之前，必须除去杂质和酶溶液。原生质体纯化方法包括离心沉淀法、悬浮法和界面法。(1)用离心沉淀筛(400目)过滤，除去未消化的细胞、细胞块和碎片，然后在适当的试剂(甘露醇)中低速离心。优点和缺点：它相对简单，但不容易去除一些完整的细胞，或造成原生质破裂，2)漂浮法可以根据原生质体的小比重在具有一定渗透压(如25%蔗糖)的溶液中漂浮来收集。优点和缺点：可以获得相对纯净和完整的原生质体。然而，完整原生质体的数量相对较少。3)沉淀法和漂浮法结合，先沉淀后漂浮，重复操作，纯化后可用于培养或细胞融合。界面法(interface method)是用两种比重不同的溶液在两个液相的界面上制作原生质体，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体在两种溶液之间。优点和缺点：可以接收大量的纯原生质体，同时避免原生质体在收集过程中由于相互挤压而破碎。以柑橘为例，进行原生质体分离纯化的流程图，目的：检查获得的原生质体是否是真正的原生质体鉴定方法(有无细胞壁):(4)原生质体鉴定，低渗透爆破法：原生质体在低渗透溶液中膨胀，观察是否有细胞壁碎片；荧光染色：用荧光增白剂染色后，通过离心去除多余的染料。在荧光显微镜下(波长3600-4400)，绿光显示纤维素，红光显示真正的原生质体。细胞质循环法：根据是否有细胞质循环来判断原生质体的活力；渗透压改变方法：活原生质体的体积会随着外部渗透压的改变而改变。氧电极法：活原生质体在光下进行光合作用并释放氧气，不需要光呼吸和耗氧。影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态；酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶液渗透压；分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法和分离时间；环境条件：操作环境的温度和分离工具的影响。原生质体培养(1)培养基1。渗透压：原生质体的渗透压是基于培养基和细胞等渗渗透压的原理。常用渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等。2.无机盐3。有机成分：维生素、氨基酸、糖和糖醇、酵母提取物、水解酪蛋白等。4.激素类：常用激素类：NAA、吲哚乙酸、丁酸和2，4-D5。(2)原生质体培养法，液体浅层培养固体培养液-固体双层培养琼脂糖珠培养，(3)影响原生质体培养的主要因素，基因型：如番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析，证明愈伤组织的再生能力由两个显性基因决定；原生质体的来源：供体材料的类型，供体细胞的分化程度，供体细胞生长的同步性；初始培养密度和培养基：基本初始密度、培养基激素水平、培养基营养成分的密度和完整性。原生质体的发育和植物再生，完整的细胞，一般包括以下步骤：1)细胞壁再生：体积扩大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变为椭圆形。(2)分裂：通常在培养2-3天后，细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质合成增加，细胞分裂形成小细胞团，并发展成愈伤组织或胚状体。3)植物再生，第一次分裂，第二次分裂，第三次分裂，多细胞团，宏观细胞团，愈伤组织，愈伤组织，植物原生质体培养的应用，1，通过原生质体融合获得融合细胞2，通过原生质体转化外