酶的分离提纯分析.ppt

Chapter3TheExtraction，separationandpurifictionofenzyme，酶的分离纯化：郑穗平，contntsofchapter 3，1，酶的提取和分离纯化技术途径，2，细胞破碎，3，酶的提取，4，酶的分离方法，Go，Go， Go 5、酶的组合分离纯化策略、Go，6、酶的浓缩、干燥和结晶、Go、细胞结构和酶分布、3.1酶的提取、分离纯化技术途径、细胞破碎、酶提取、酶分离纯化、酶浓缩、酶贮藏、动物、植物或微生物细胞、发酵液、离心分离、沉淀分离、色谱分离、电泳分离、提取分离、结晶分离等。 酶的纯化过程大致可分为3个阶段： (1)粗蛋白(crudeprotein):取样均质破碎细胞提取全蛋白，可大致去除多采用盐析沉淀法的蛋白质以外的物质。 (2)部分纯化(partiallypurified):的初步纯化采用各钟柱色谱法。 (3)同源酶(homogeneous):目标酶的进一步纯化可以使用调制式电泳或HPLC。 酶分离纯化的不同阶段，本章的目录，3.2细胞破碎多种酶存在于细胞内。 提取这些细胞内酶，首先需要破碎处理细胞。 1 )机械破碎2 )物理破碎3 )化学破碎4 )酶性破碎、JY92-IID超声波细胞破碎机、细胞破碎珠、高压细胞破碎机、DY89-I型电动玻璃均化器、机械破碎、破碎法的破碎法、物理破碎、温差破碎法的压力差破碎法超声波破碎法、化学破碎、有机溶剂：甲苯、 丙酮丁醇、氯仿表面活性剂： Triton、Tween、酶促破碎、自溶酶制剂法、机械运动剪切力破碎组织、细胞。 由于、各种物理因素的作用，组织、细胞的外层结构被破坏，细胞被破碎。 通过各种化学试剂对细胞膜的作用破碎细胞，通过细胞本身的酶系或酶制剂的催化作用破坏细胞的外层结构，达到细胞破碎方法及其原理，本章的目录、酶的提取是指在一定条件下用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解于溶剂或溶液中的过程。 也称为酶的提取。 酶提取应首先根据酶的结构和溶解性选择合适的溶剂。 一般来说，极性物质容易溶于极性溶剂，非极性物质容易溶于非极性有机溶剂，酸性物质容易溶于碱性溶剂，碱性物质容易溶于酸性溶剂。 酶可溶于水，但通常可以用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等萃取，一些酶可以与脂质结合，或者含有大量非极性基团时可以用有机溶剂萃取。 3.3提高酶的提取、温度、降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离、增大浓度差有助于提高酶分子的扩散速度。 提高酶的提取率，防止酶的改性失活，提取过程中应注意控制温度、pH等提取条件。 酶的主要提取方法是在大多数蛋白酶溶于水且存在低浓度盐的条件下，酶的溶解度随盐浓度的上升而增加，称为盐溶解现象。本章目录、3.4酶的分离方法、1、沉淀分离、2、离心分离、3、过滤和膜分离、4、色谱分离、Go、Go、Go、5、电泳分离、Go、6、提取分离、Go、本章目录、1、沉淀分离、沉淀分离通过改变某个条件或添加某种物质，降低酶的溶解度，从溶液中沉淀析出盐浓度达到某一极限后，酶的溶解度随盐浓度的增加而降低，称为盐析现象。 在一定的温度和pH条件下(为常数)，通过改变离子强度分离不同酶和蛋白质的方法称为Ks段盐析。 另一方面，在一定的盐和离子强度条件下(KsI为常数)，通过改变温度和pH来分离不同酶和蛋白质的方法称为段盐析。 蛋白质的盐析通常使用硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。 其中硫酸铵是最常用的。因为硫酸铵在水中溶解度大，温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价格便宜易得。 但是，用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力差，铵离子的存在会妨碍蛋白质的测定，因此有时也用其他中性盐进行盐析。 在盐析的情况下，溶液中硫酸铵的浓度通常用饱和度来表示。 有机溶剂沉淀析出酶的原因。 主要由于有机溶剂的存在，溶液的介电常数降低。 例如，20下的水的介电常数为80，82 %乙醇水溶液的介电常数为40。 溶液的介电常数下降时，溶质分子之间的静电引力增大，相互吸引容易凝聚，同时在具有水膜的分子中，有机溶剂和水相互作用破坏溶质分子表面的水膜，降低其溶解度使其沉淀析出。 酶沉淀分离常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等，本节的目录、2、离心分离、离心分离是离心机旋转产生的离心力，是分离大小和密度不同物质的技术过程。 根据要分离的物质和杂质粒子的大小、密度、特性，选择合适的离心机、离心方法和离心条件进行离心分离。 常速离心机又称低速离心机，其最大转速在8000r/min以内，相对离心力(RCF )在1104g以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固态物的分离。 也用于酶的结晶等大粒子的分离。 高速离心机的最大转速为(12.5)104r/min，相对离心力达到11041105g，酶的分离主要用于沉淀、细胞碎片、细胞器等的分离。 为了防止在高速离心的过程中温度上升导致酶的变性失活，有配备冷冻装置的高速冷冻离心机。 过速离心机的最大转速达到(2.512)104r/min，相对离心力达到5105g以上。 速度离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物高分子和细胞器、病毒等的分离纯化的样品纯度的检测沉降系数和相对分子质量的测定等。 超速离心机根据其用途分为制造用速离心机、分析用速离心机和分析-制造两用速离心机3种，蛋白质分子在离心时分子量、分子密度、组成、形状等影响沉降速度，沉降系数用于记述该沉降特性的单位为S(Svedbergunit )。 各沉降系数与分子密度和分子量成正比。 不同沉降系数的蛋白质可以利用超高速离心法在密度梯度中分离。 在本节中，3、过滤和膜分离、过滤是根据过滤介质分离不同大小、不同形状物质的技术过程。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属、各种高分子膜等，可根据需要进行选择。 过滤，非膜过滤：以高分子膜以外的物质为过滤介质，膜过滤：以各种高分子膜为过滤介质，通过过滤的分类及其特性(根据被过滤介质捕获的物质粒子的大小不同)、一定孔径的高分子膜，分离不同大小、不同形状和不同特性的物质粒子和分子的技术称为膜分离技术。 膜分离所使用的膜是主要由丙烯腈、醋酸纤维素、玻璃纸、尼龙等高分子聚合物构成的高分子膜。 也有采用动物膜等的情况。 在膜分离过程中，膜的作用是选择性地使小于其孔径的物质粒子和分子通过，捕获大于其孔径的粒子。 膜的孔径有多种规格。 根据膜分离、加压膜分离、微滤膜过滤反渗透、电场膜分离、电透析离子交换膜电透析、扩散膜分离、透析、膜材料不同的供给液的特性，适用于商品的膜制品通常采用以下结构形式。 中空纤维； 卷式平板电脑型。4种常用膜分离技术的基本特点，4种常用膜分离过程的陷阱特性，又称本节目录、4种色谱分离、色谱技术，是一种物理分离方法。 利用混合物中各成分的物理化学性质的不同，使各成分以不同的程度分布在两个相中，一个相为固定相(称为固定相)，另一个相流过该固定相(称为流动相)，使各成分以不同的速度移动分离。 色谱分离方法、吸附色谱是利用吸附剂对物质吸附力的差异来分离混合物中各成分的方法。 吸附色谱是各种色谱技术中最早的技术。 吸附剂来源丰富，价格低廉，可再生，吸附设备简单。 吸附色谱通常采用柱型装置，将吸附剂放入吸附柱中，制成吸附色谱柱。 色谱法的情况下，从色谱柱顶部加入想要分离的混合溶液，样品液全部进入吸附色谱柱后，加入洗脱剂进行解吸洗脱。 洗脱时，柱内继续进行解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。 溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法、分配色谱法、分配色谱法是利用各成分两相中的分配系数不同来分离各成分的方法。 分配系数是指溶质溶解在互不相容的2种溶剂中达到平衡时，该溶质在2种溶剂中的浓度之比。 断层条件确定后，断层系数一定。 在分配色谱中，通常滤纸、硅藻土、纤维素等多孔性固体支撑体在色谱中总是吸附固定在多孔性支撑体上的溶剂而形成固定相。 与固定相溶剂不相容的另一种溶剂可沿固定相流动，称为流动相。 当某种溶质牵引流动相流过固定相时，该溶质在两相间连续动态分配。 纸的色谱是在薄层色谱中分配气相色谱，离子交换色谱是利用离子交换剂上离解性基团(活性基团)对各离子的亲和力差异来达到分离目的的色谱分离方法。 离子交换剂是含有几个活性基团的不溶性高分子物质。 通过在不溶性高分子物质(母体)中导入几个解离性基团(活性基团)制作而成。 根据活性基团的性质，离子交换剂可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。 酶分子具有两性性质，无论是阳离子交换剂还是阴离子交换剂都可以分离纯化酶。 凝胶色谱又称凝胶过滤、分子阻断色谱、分子筛色谱等。 是一种以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各种成分的相对分子质量的差异来实现物质分离的色谱技术。 凝胶色谱柱中加入了多孔凝胶，含有各种成分的混合溶液在凝胶色谱柱中流动时，由于高分子物质的分子径大，不能进入凝胶的细孔，分布在凝胶粒子的间隙中，以快速流过凝胶柱。 小分子进入凝胶的细孔内，不断进出粒子的细孔内外，小分子物质的移动速度变得比大分子的速度慢，混合溶液中的各成分按照相对分子质量从大到小的顺序流出色谱柱，达到分离的目的。 常用凝胶：葡聚糖凝胶与琼脂糖凝胶的聚丙烯酰胺凝胶、亲和层析是利用生物分子与配体之间特异、可逆的亲和力分离纯化生物分子的技术。 酶与基质、酶与竞争抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、与酶RNA互补的RNA分子或片段、与RNA互补的DNA分子或片段等之间，均为具有特异性、可逆亲和力的生物分子对。因此，亲和层析在酶的分离纯化中有重要的应用， 常用的亲和色谱法和特异性配体，根据想要分离的成分和配体的结合特性，亲和色谱法， 共价亲和层析的金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析和亲和层析的基本原理，本节目录，5，电泳分离，带电粒子在电场中与其自身带电的电荷相反的电泳方法根据所使用的支持体不同，分为纸电泳、薄层电泳、薄层电泳、凝胶电泳、自由电泳等电聚焦电泳，粒子在电场中的迁移速度主要取决于其自身具有的净电荷量，受粒子形状和粒子大小的影响。 另外，还受到电场强度、溶液的pH值、离子强度、支撑体的特性等外在条件的影响。 调制式电泳通常在不含SDS状态的disc-PAGE中进行，回收活性蛋白质的蛋白质样品首先要部分精制。 否则效果不好，首先要用分析式电泳来定位目标带。 本节的目录、6、萃取分离、萃取分离是利用物质在两相中溶解度的不同进行分离的技术。 萃取分离中两相一般是互不相容的两种液相。 有时也采用其他流体。 根据两相的组成，萃取可分为有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取、各种双水相体系、一些超临界流体的超临界点和超临界密度、本节目、3.5酶的组合分离纯化策略、分离纯化工艺的基本要求、本节目、3.6酶的浓缩、干燥和结晶、浓缩和干燥以及酶与溶剂(通常为水)的分离过程。 是酶的分离纯化过程中的重要环节。 离心分离、过滤和膜分离、沉淀分离、色谱分离等发挥浓缩作用。 硅胶、聚乙二醇、干凝胶等各种吸水剂吸收水分也能达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或减压方法使溶液中的溶剂的一部分气化蒸发，浓缩溶液的过程。 酶在高温条件下不稳定，易变性失活，酶液浓缩通常采用真空浓缩。 即，在一定真空条件下将酶液在60以下浓缩。 在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输、使用，一般需要干燥。 常用的干燥方法是真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥，晶体是溶质以晶