多糖的分离和纯化

一、多糖的分离纯化多糖是极性极高的高分子化合物。在提取过程中，通常先对原料进行脱脂和脱色，然后在不同温度下用水、盐或稀碱水提取。提取物浓缩后，加入沉淀剂(乙醇、丙酮等。)进行离心沉淀，沉淀部分可以多次反复离心沉淀，除去一些杂质，如水溶性颜料。1.脱蛋白用水或稀碱提取的多糖通常含有蛋白质。常用的去除蛋白质的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等。前两种主要用于微生物多糖，而后者主要用于植物多糖。Sevag法是去除蛋白质的经典方法，该方法复杂、耗时且样品损失大。封建林等人比较了Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、硫酸铵法和木瓜蛋白酶复合酶法对蛋白质去除的效果，并从蛋白质残留和多糖得率两个方面进行了评价。他们认为三氯乙酸法最好，但三氯乙酸仍不能完全去除蛋白质，建议三氯乙酸法和Sevag法结合使用。2.脱色多糖通常含有一些色素(游离色素或结合色素)，可以根据它们的不同性质将其除去。法律。常见的脱色方法包括离子交换法、氧化法、金属络合法和吸附法(纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等)。)。醋酸纤维素是目前最常用的脱色方法。离子交换柱不仅可以实现脱色，还可以分离多糖。H2 O2:是一种氧化脱色剂，其浓度不宜过高。应在低温下进行，否则会导致多糖降解。对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可以通过产生金属络合物的方法同时除去蛋白质和色素，即加入铁试剂以产生不溶性络合物，并在分离后用阴离子交换树脂分解络合物。吸附脱色也是常用的，如用活性炭、高岭土和硅藻土柱脱色。3.多糖的分类用常规方法提取的多糖通常是多糖的混合物，即多分散性，它们的异质性是显而易见的。化学成分、聚合度、分子形状等不同。分类可以达到纯化的目的，并且可以根据分子大小和形状进行分类(例如分级沉淀、超滤、分子筛、色谱等)。)，或者根据分子携带的基团的性质(例如电泳、离子交换色谱等)。根据电荷的性质分类)。(1)分步降水根据分子大小和溶解度，有两种常用的分离方法，即有机溶剂沉淀法和季铵法。铵盐或硫酸铵法。Ba (oh2)、ca (oh2)等。也常用于酸性多糖的分类。(2)柱色谱柱色谱法是常用的，可分为两种类型。一种是只有分子筛的普通凝胶柱色谱，如葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、生物凝胶等。一种是离子交换色谱，它不仅具有不同的电荷性质，还具有分子筛的功能。例如，带负电荷的多糖可分为阴离子纤维素柱和葡聚糖凝胶柱。酸性多糖可在阳离子羧甲基(CM-Sephadex)或黄乙基(SE-Sephadex)凝胶柱上分离。这种离子交换树脂通常通过用水、不同浓度和类型的缓冲溶液或酸碱溶液洗脱来分馏。中国仍采用经典的苯酚-硫酸法，国外采用LKB柱色谱系统。特定旋转、视差折射和紫外探测器用于自动记录每个组件的峰值位置。分离效果好、方便。(3)透析、超滤和超速离心在一定条件下，选择不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤、透析和超速离心。多糖可以根据分子大小分类。超滤和透析更常用于去除小分子取50L 0.5%多糖PW2样品溶液，在距终点1cm处的新华中速滤纸(3cm20cm)中间取样，以正丁醇、浓氨水和水(40505)为展开剂，饱和2小时以上，室温下展开6小时，取出干燥，用0.5%甲苯胺蓝溶液染色，立即用95%乙醇冲洗，直至背景褪色。3.凝胶柱色谱法deae e-纤维素52(2.6cm100cm)柱层析，0.1molL-1N aCl洗脱，流速为6mLh-1，用2mL试管逐管收集，苯酚-硫酸法试管逐管检测，绘制收集体积与糖含量的关系曲线。4.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖平板(厚度：0.2厘米)用3 5 L浓度为0.075摩尔-1、酸碱度为8.6的巴比妥缓冲液染色，电泳1 1.5h，电压64 80V，甲苯胺蓝(浓度：1%)染色，乙酸和乙醇的混合溶液(乙酸乙醇水=0.155)脱色。用电泳法开发出多糖W2纯品。5.红外光谱分析取微量干样，压片，全波扫描。6.核磁共振分析样品10毫克溶解在D2O(重水)中，溶解温度为80，1HNM R和CNM R分别在400兆赫和500兆赫测定。三。结构鉴定多糖的化学研究首先是提取、分离和纯化，得到不同的多糖成分，纯度鉴定证明如下多糖均质后测定各组分的溶解度、旋光率、粘度、分子量等理化性质，然后进行平面立体化学研究和结构修饰研究。经典的和通用的多糖结构鉴定方法通常根据图1的程序进行。在确定多糖结构之前，必须检查分类和纯化后多糖的纯度和分子量。目前，纯度检验最常用的判断方法包括：1)用气相色谱和液相色谱测定单糖组成多糖的摩尔比是否恒定。使用不同的柱类型测量结果更可靠。2)电泳中仅出现一条条带。例如，可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳和玻璃纤维纸电泳。对于中性多糖，可以使用高压电泳，用硼酸盐作为缓冲液来提高其迁移速度。3)凝胶柱色谱显示对称的单峰。如果存在“拖尾”现象，均匀性就不够好。4)纸层析显示单一浓缩斑点。过去，多糖的分子量是通过超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法等测定的。这些方法操作复杂，误差大，现在很少使用。目前，更常用的方法是凝胶过滤和高效凝胶液相色谱。这两种方法必须首先通过比较标准多糖和已知分子量来确定样品的分子量。多糖的生物大分子结构比蛋白质的更复杂，不仅因为组成多糖的单糖种类多(目前已知的单糖有200多种)，而且因为由单一单糖组成的多糖由于连接方式和可能的支链不同(蛋白质支链很少)，结构鉴定非常困难。多糖的结构鉴定方法很多，主要分为三类，即化学分析、物理分析和生物方法。3.1化学分析3.1.1酸水解澄清结构的第一步是鉴定多糖的单糖组成。酸水解是一种常见的方法，并适当的条件(酸的类型，浓度，温度，水解时间等。)可以根据需要选择。现在酸水解法已经完全自动化了。3.1.2甲基化甲基化方法不能解决多糖中单糖的连接顺序，但阐明单糖(键)的连接方式是非常重要的类型)，重复结构中单糖的数量，末端糖的性质和分支点的位置都非常有用。P各种赤藓糖醇糖苷或甘油糖苷可以通过在室温下用稀酸对多元醇进行部分酸水解来获得。研究这些单糖苷、二糖苷和寡糖苷的结构有助于阐明多糖中单糖的部分连接序列和键类型。3.1.5碱降解与单糖的羟基或羧基相连的酯发生碱降解，多糖还原端的单糖被一个接一个地剥离出来使用可以分析多糖的键类型。3.1.6酶水解这是控制多糖降解的另一种方法。它主要根据特定的酶降解具有特定结构的多糖。阐明多糖的部分结构。3.1.7免疫化学技术多糖是许多微生物免疫特异性的决定因素。根据多糖抗原和蛋白质抗体的多个反应基团的特异性，只有具有一定结构的多糖才能与特定类型抗体的蛋白质相互作用。如果可以制备针对未知多糖的抗体，这种抗体可以用于阐明未知多糖的类似结构。3.2物理分析3.2.1红外线红外光谱主要用于确定吡喃糖的糖苷键构型和观察其他官能团。一般来说，主要观察到730 960 cm-1的范围。对于-吡喃糖，C1-H为845厘米-1，而-吡喃糖C1-H为890厘米-1。3.2.2 M S、G C-M S多糖的气相色谱分析受样品挥发性和热稳定性的限制，但气相色谱-质谱联用是多糖结构分析不可缺少的工具，特别是对水解单糖、甲基化单糖和甲基化寡糖的分析，并能识别糖的异构体。质谱因其快速、灵敏、样品用量少等优点，在糖链结构分析中得到了越来越广泛的应用。申请。不仅需要鉴定各种甲基衍生物的片段，以便确定各种单糖残基的附着位置很少，近年来由于快速原子轰击质谱(fam-ms)、电喷雾电离质谱(ESI-ms)和基质辅助随着激光解吸电离飞行时间质谱的出现，质谱还可以测定糖链和糖的分子量链条的主要结构。电喷雾质谱是目前最软的电离技术。因为它能形成多电荷离子，所以它能测量分子量接近100，000的大分子。电喷雾干燥系统易于与可编程序控制器、毛细管电泳、SFC等技术相结合，大大提高了工作效率、灵敏度和准确度。电喷雾质谱和离子交换色谱的结合可以得到不同的片段离子，从而得到分子量、连接序列和支链信息低于pmol(10-12mol)的寡糖及其复合物。V ernon等人研究了多糖的分子量、序列、链连接和分支。电喷雾质谱是一种清洁、灵敏的方法，也可与串联质谱联用来确定寡糖混合物的结构。ALDI质谱也是一种类似于电喷雾质谱的软电离技术。与硅质谱一样，这种电离技术产生稳定且难以裂解的分子离子，非常适合于以极高的准确度测定生物大分子样品。测得的分子量与分子形状无关(不同于色谱法和电泳法)，因此非常适合于测定多糖的分子量和大小分布。此外，malaldi法不受样品中无机盐缓冲液的影响，其灵敏度也是所有方法中最高的。1 mol样品在5 min内最多可获得0.5的寡糖分子量差准确度。3.2.3北地中海用核磁共振技术研究糖链结构的优点是不会破坏样品。糖链的结构特征用化学位移、耦合常数、积分面积、氮氧当量和弛豫时间来表示。早期的核磁共振主要用于解决多糖结构中糖苷键的构型和重复结构中单糖的数量。近年来，核磁共振技术的快速发展为生物大分子的结构研究创造了有利条件。例如，在确定多糖的单糖组成时，除了氢-氮分子和“碳-氮分子”的化学位移信息之外，还可以使用二维光谱，例如氢-氢-一氧化碳系统和氢-碳-一氧化碳系统。在确定单糖的类型和结构时，可以使用氢-氢-dq-f-C-osy、R-C-T、T-o-C-SY、H-o-H-A-HA、H-ET-Co-R-H-M-Q-C。氢核磁共振法可用于确定单糖的连接位置和序列，如氢-氢远程偶联j :0ch，difenoe，1D N o ER o E，2DN o E SY R o E SY，2D T o C SY R o E SY，3DTo CSY R o ESY。现有的碳氮比测定方法，如比较已知结构的单糖或寡糖的碳氮比数据、氢ET Co R氢M Q C、氢M BC、葡萄糖IS、单肽、双肽T、PT、L R H-C o N E C T IV IT Y和nC I H N o E、测定T(单糖在糖链中的移动自由度与T有关)等。Paw an等人综述了一维和二维n-m r在分析糖的构型、相互连接位置和序列方面的应用。唐文杰等人开发了一套专门用于多糖结构分析的计算机专家系统cs，大大简化了复杂而耗时的多糖结构研究工作。多糖结构分析的h-n m r和c-n m r的技术和分析程序见图2。单糖类型、环大小(呋喃环或吡喃环)和10 h位置来确定多糖或寡糖的结构，字段2 N M R为多糖结构的鉴定方法和程序3.2 .4摄氏度毛细管电泳是近年来发展起来的一种糖类分析方法。它因具有快速、高效、高分辨率和样品消耗少等优点，越来越受到糖化学家的关注。毛细管电泳主要用于多糖结构研究中多糖的分子量(不同质量和电荷的分子电泳迁移率)、成分分析、纯度鉴定、结构归属和单糖差向异构体的分离。结合寡糖降解方法，寡糖的结构分析也可以通过确定寡糖降解片段的结构并根据结构优化原理来实现。毛细管电泳具有快速、高效、高分辨率和样品用量少的优点，在复杂多糖的结构分析中具有重要价值。它不仅可以直接分析多糖，获得多糖微观异质性信息，还可以对多糖n的酶解产物进行定量和定性分析。此外，ce-m s组合可以在细胞水平上准确分析极少量的多糖。需要注意的是，毛细管电泳分析结果的重现性较差，在取样方法和定量分析方面还需要进一步的技术改进。3.3生物方法生物学方法主要是酶学方法，即通过各种特定的糖苷酶水解多糖分子以获得寡糖片段，然后结合其他定性和定量方法来推断多糖的结构。目前比