蛋白酶溶菌酶.ppt

蛋白酶水解示意图：1.1蛋白质的特殊要求，第1组，R1和R2的性质：糜蛋白酶只能水解R1侧链的肽键，即酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基；胰蛋白酶只能水解侧链的肽键，其中R1是精氨酸或赖氨酸残基。胃蛋白酶和羧肽酶对R2组有特殊要求。如果R2是苯丙氨酸残基的侧链，那么这两种酶可以以最快的速度水解肽键。氨基酸构型：必须是l型。所有天然蛋白质都属于l型。3.底物分子大小：如上所述，对于胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，底物分子大小并不重要。4、x和y属性：x和y可以是-H、-OH，或者它们可以连续导出。(1)如果是内肽酶，在R1和R2满足特定要求的前提下，肽链可以分裂。显然，在内肽酶活性达到最高水平之前，X和Y必须继续衍生。x和y可以是氨基酸残基。(2)对于肽基末端酶的羧肽酶，底物中的Y要求为-OH，其特异性对R2有严格要求。当x不是-H时，它能显示出很高的生命力。(3)对于作为肽链末端酶的氨肽酶，要求底物中的X为-H，优选Y不为-OH，特异性在R1上显示。对肽键的要求：大多数蛋白酶不仅仅限于肽键的水解，还能作用于酰胺(-NH2)、酯(-COOR)、硫醇酯(-COSR)、异羟酸(-CONHOH)胃蛋白酶和其他对水解键具有高识别能力的酸性蛋白酶。例如，肽键脂键，即使R2符合要求，它也不能用作底物。1.2蛋白酶分类：1.3木瓜蛋白酶：其酶活性位点含有巯基，属于巯基蛋白酶。木瓜蛋白酶存在于分子量为23，900的番木瓜汁中。该酶的活性位点至少存在3个氨基酸残基，即半胱天冬酶25(半胱天冬酶)、组氨酸159(半胱天冬酶组)和天冬酶158(天冬酶组)。当Cys25被氧化剂氧化或与重金属离子结合时，酶活性被抑制，而还原剂半胱氨酸(或亚硫酸盐)或乙二胺四乙酸可恢复酶活性。还原剂的作用：乙二胺四乙酸螯合-S-S 3354-SH中的重金属离子。木瓜蛋白酶在pH5时具有良好的稳定性，但在pH11时酶很快失活。最适的酸碱度因底物而异。木瓜蛋白酶具有很高的耐热性。酶溶液在pH7和70下加热30分钟，但凝乳活性仅降低20%。木瓜蛋白酶对酯和酰胺底物显示出高活性。1.4酸性蛋白酶：(强调糜蛋白酶)。酸性蛋白酶是指具有较低最适酸碱度的蛋白酶，而不是存在于酶活性位点的酸性基团。酶的活性位点含有一个或多个羧基。凝乳酶与胃蛋白酶和凝乳酶是存在于泌乳犊牛第四胃的蛋白酶，并作为非活性酶原分泌。随着犊牛的生长，当母乳的摄入量变为草和谷物时，凝乳酶的量减少，而胃蛋白酶的量增加。当凝乳酶从非活性酶原转化为活性酶时，它经历部分水解，其分子量从36，000降低到31，000。在pH5时，酶原主要被自催化激活，而在pH2时，激活过程进行得非常快。凝乳酶在pH5.36.3时最稳定，在pH3.54.5时由于自身消化而失活。中性和碱性范围内无凝乳活性。凝乳酶催化酪蛋白沉淀是奶酪制作中非常重要的一步。原料乳灭菌加入发酵剂、凝乳酶和色素形成凝块，乳清被去除，切成碎片，搅拌，加热(氯化钙浓度为20.01%)，被成型，压制，腌制，发酵，熟化，着色和上蜡成品，1.5蛋白酶水解蛋白的苦味来源是：水解蛋白酶的苦味与蛋白质的原始氨基酸组成有关。特别是，蛋白质中的疏水性氨基酸是蛋白质水解后产生苦味肽的重要原因。当蛋白质处于自然状态时，这些氨基酸被埋藏在蛋白质结构中，因此对蛋白质的味道没有明显的影响。在酶水解过程中，小肽的数量会增加，从而暴露这些疏水性氨基酸，当它们与味蕾相互作用时会产生苦味。如果在一定阶段采用受控的酶水解来停止蛋白质的水解反应，并且肽键具有足够的长度来将疏水性氨基酸包埋在其结构中，则可降低水解蛋白质的苦味。通常，大约20%的蛋白质被水解，并且不容易产生苦味肽。1.6蛋白酶作为食品添加剂的应用：1.6.1木瓜蛋白酶主要用于菠萝炒牛肉作为肉类嫩化剂。从屠宰老动物中获得的肉在烹饪后尝起来又粗又硬。肉中含有一定量的胶原蛋白，随着动物年龄的增长，胶原蛋白交联的数量和强度增加。木瓜蛋白酶的作用可以从肉的感官评价和剪切力测量中看出。1.6.2绿茶饮料的浊度：浊度物质主要由蛋白质(1565%)和多酚类化合物(1035%)组成，俗称茶奶酪，是绿茶饮料生产的关键。加入木瓜蛋白酶去除绿茶提取物中的蛋白质，有利于绿茶饮料的稳定。水解氨基酸酱油的生产主要以水解蛋白为原料。蛋白质水解的方法包括酸解和酶解。然而，三氯丙醇会被带入盐酸水解的溶液中，研究证明盐酸是一种致癌物。在中国，酱油中曾检测到三氯丙醇，并被欧洲退回。因此，解决酱油三氯丙醇制备问题的最佳途径是通过酶解蛋白质获得水解产物。溶菌酶，溶菌酶(N-乙酰木黄酮聚糖水解酶，EC3.2.1.17)，也称为木黄酮酶，是一种特异性作用于微生物细胞壁的水解酶。2.1溶菌酶的发现1922年，患感冒的英国细菌学家亚历山大雷明发现，在细菌培养基中加入一些鼻涕会导致细胞溶解。然而，这种存在于鼻粘液中并能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶。弗莱明称之为溶菌酶。当时，他认为溶菌酶的临床价值很低，所以他放弃了研究，在1928年发现了青霉素。弗莱明(1881-1955)因发现青霉素而获得1945年诺贝尔奖。2.2溶菌酶的来源，溶菌酶商业制剂的最重要来源。溶菌酶在生物体内的生理功能。生物体内的溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒和增强免疫力的生理功能。还能激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防御功能，具有止血、消肿等功能。它可以用作宿主抵抗因子，以局部保护组织。2.3溶菌酶的性质，溶菌酶是由129个氨基酸组成的纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。溶菌酶纯品为白色或微黄色，黄色晶体或无定形粉末，无异味，微甜，易溶于水，在碱中易损坏，不溶于乙醚。蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的。蛋清中酶的含量约为3.5%，分子量为14000。(1)蛋清溶菌酶的最适作用温度为50，化学性质稳定。当pH值在1.2和11.3之间变化时，对酶结构的影响很小，在碱性环境中稳定性较差。当pH值在4 7范围内时，经100处理1分钟仍有接近100%的活性，经210加热1.5h仍有活性。(2)化学物质对溶菌酶的影响。氯化钠、糖和聚烯烃能增加溶菌酶的热稳定性。盐溶液的存在对于溶菌酶的活性是非常必要的，但是在高盐浓度下溶菌酶的活性受到抑制，阳离子的化合价越高，抑制越强。含-COOH和-SH3OH基团的多糖对溶菌酶活性有抑制作用。(3)络合作用对溶菌酶活性的影响。溶菌酶可以与许多物质形成复合物，导致其活性丧失。等量的蛋清和蛋黄的混合物不具有溶菌酶活性，脱水的全蛋仅保留部分溶菌酶活性，蛋黄在pH6.2的磷酸盐缓冲液中灭活纯溶菌酶。研究人员认为，这种抑制机制是由溶菌酶和蛋黄化合物之间形成的静电相互作用复合物引起的。N-乙酰氨基葡萄糖的(1-4)键聚合物是溶菌酶的底物。它们形成单体、二聚体、三聚体和四聚体，它们是溶菌酶的抑制剂。SDS与活性位点的结合强烈抑制此外，与溶菌酶形成复合物的其它物质包括胸腺泡核、酵母泡核、甲状腺素、甲状腺球蛋白、-镧、咪唑核吲哚衍生物。阳离子如Co2、Mg2、Hg2、Cu2等。能抑制溶菌酶活性(10-3 10-2摩尔/升)。2.4溶菌酶的抗菌机理。溶菌酶能有效水解细菌细胞壁的肽聚糖。它水解位点是N-乙酰氨基葡萄糖酸的1个碳原子和N-乙酰氨基葡萄糖的4个碳原子之间的-1，4糖苷键。结果，细菌细胞壁变得疏松，失去了对细胞的保护作用。最后，细胞溶解并死亡。肽聚糖的结构，水解位点，对于G细菌和G细菌来说，细胞壁中肽聚糖的含量是不同的，G细菌的细胞壁几乎完全由肽聚糖组成，而G细菌只有肽聚糖的内壁层，因此，溶菌酶只能破坏G细菌的细胞壁，而对G细菌几乎没有影响。溶菌酶在食品中的应用2.5.1溶菌酶用于水产品、熟食和肉制品的保鲜。溶菌酶可用作水产熟食如鱼丸和肉类熟食如香肠和香肠的防腐剂。只要将一定浓度(通常为0.05%)的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，它就能起到保鲜的作用。为了保存新鲜的海鲜和水产品，一些新鲜的海鲜和水产品(如虾、蛤肉等)。)浸泡5分钟0.05%溶菌酶和3%盐溶液5分钟，然后沥干并在室温或冷藏下储存以延长它们的储存期。溶菌酶在乳制品中的应用母乳中溶菌酶的最高含量是牛奶的3000倍，是羊奶的1600倍。溶菌酶是婴儿生长发育所必需的抗菌蛋白。在人工喂养或母乳不足的婴儿食品中添加溶菌酶是非常必要的。它对杀死肠球菌有特殊效果，并增加对感染的抵抗力。直接或间接促进婴儿肠道细菌中双歧杆菌的增殖，促进婴儿胃肠酪蛋白精细凝乳的形成，促进婴儿的消化吸收；溶菌酶在干酪生产中的应用，特别是在中长期老化的干酪中的应用，可以防止干酪后期起泡和干酪风味的改变，并且在老化过程中不影响干酪基液。溶菌酶不仅有利于乳酸菌的生长，而且能抑制被污染细菌引起的丁酸发酵，这是普通防腐剂所不能达到的。溶菌酶也可用于乳制品的保存，尤其是巴氏杀菌牛奶，这可以有效地延长其货架期。因为溶菌酶具有一定的耐高温性，所以它也适用于超高温速溶巴氏杀菌乳。溶菌酶在蛋糕和饮料中的应用向蛋糕中添加溶菌酶可以防止微生物的繁殖，尤其是含有奶油的蛋糕更容易腐败，向蛋糕中添加人溶菌酶也可以起到一定的防腐作用。在pH 6.0 7.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有良好的防腐效果。低度葡萄酒的应用是日本成功地用蛋清溶菌酶代替水杨酸作为防腐剂保存清酒，添加量为15毫克/公斤。此外，溶菌酶还可用作料酒和葡萄酒的防腐剂和澄清剂，用量为0.005%-0.05%。用于制备细胞提取物的酵母提取物是发酵工业中最常用的培养基成分，其制备目前主要通过酵母自溶或糖酵解进行。如果用溶菌酶代替酵母抽提物，可以提高抽提物的产量，大大缩短酵母抽提物的制备时间。溶菌酶也可以用来从酵母细