细胞基因组DNA的提取...ppt

细胞基因组DNA的提取，印伟中山医学院生物化学系，实验1细胞基因组DNA的提取，1。实验原理，1。核酸分类。DNA主要存在于细胞核的染色体中。细胞核外还有少量的DNA，如线粒体DNA(mtDNA)、叶绿体DNA(cpDNA)、质粒DNA。核糖核酸存在于细胞质中，如核糖核酸、核糖核酸、核糖核酸等。除了上述的脱氧核糖核酸和核糖核酸之外，还有非细胞形式的病毒和噬菌体，它们要么只含有脱氧核糖核酸，要么只含有核糖核酸。核酸分离纯化的一般原则：保证核酸一级结构的完整性；(2)消除其他分子的污染。核酸纯化需要满足的要求：核酸样品中不应有对酶有抑制作用的有机溶剂和过量的金属离子浓度；(2)其他生物大分子的污染应减少到最低限度；(3)消除其他核酸分子的污染。核酸制备的一般原则，首先是实验原理，核酸制备中的注意事项：尽可能简化操作步骤，缩短提取过程。(2)减少化学因素对核酸的降解。(3)减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温(4)防止核酸的生物降解。核酸制备的一般原理，第一，实验原理，核酸制备的步骤：细胞破碎，提取，纯化，一，材料制备。细胞分裂或胶囊内容物释放。核酸分离、纯化。核酸的沉淀或吸附，以及杂质的去除v .核酸在适当量的缓冲液或水中的溶解，核酸酶抑制和抑制剂降低温度，改变酸碱度和盐浓度都有利于抑制核酸酶活性，但不如使用核酸酶抑制剂有利，当然，几种条件的组合更好。对于脱氧核糖核酸，很容易抑制脱氧核糖核酸酶的活性，但更重要的是防止机械张力断裂。对于核糖核酸来说，由于分子很小，不容易被机械张力破坏，但很难抑制核糖核酸酶的活性，因此在核糖核酸提取中，更重要的是尝试抑制核糖核酸酶。4、核酸制备的一般方法和原理，首先是实验原理，抑制核酸酶和抑制脱氧核糖核酸酶(1)加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDATA或柠檬酸钠，脱氧核糖核酸酶基本上可以全部灭活。去污剂、蛋白质变性剂和脱氧核糖核酸酶抑制剂也能灭活脱氧核糖核酸酶。核酸酶抑制和核糖核酸酶抑制操作时应戴手套。(2)所有容器应严格消毒，(3)试剂处理，(4)低温操作，(5)分离过程中应加入一定的核糖核酸酶抑制因子。核酸制备中常用的去污剂核酸本身带负电荷，并结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的洗涤剂通常是阴离子洗涤剂。洗涤剂的功能有：1。溶解膜蛋白和脂肪使细胞膜破裂；2.溶解核糖体上的蛋白质，解聚它们，并释放核酸；3.对核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶有一定的抑制作用。例如，十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠和三异丙基萘磺酸钠。蛋白质变性剂是核酸制备中常用的蛋白质变性剂，其功能是：1 .使蛋白质变性和沉淀，并从核酸提取物中分离和除去它们，以防止蛋白质污染。2.变性蛋白质，所以核糖体可以解聚释放核酸。3.一些蛋白质变性剂也能抑制核糖核酸酶活性并破坏细胞。例如，苯酚，氯仿，盐酸胍，DEPC，脱氧核糖核酸酶蛋白酶K溶菌酶，这是常用于核酸制备和核酸提取的一般过程1)细胞分裂(防止核酸酶作用)微生物：溶菌酶，SDS裂解。高等植物：捣碎机粉碎，液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冷冻法：反复冻融或液氮冷冻后组织捣碎。动物：液氮处理后，用匀浆器压碎。细胞器DNA:首先纯化细胞器。在上述处理过程中，应同时加入核酸酶抑制剂，核酸提取的一般过程包括2)粉碎和4)核酸样品保存的主要条件是温度和中温：4(5)是最好的，最简单的-70是长期保存的好温度。一次性保存-20，保存介质：TE缓冲液(最常用)10 mmol/LTRIS-CLPH 8.01 mmol/Leddap 8.0，实验目的，材料和试剂，实验操作及注意事项。1000转/分，5分钟离心，4。注意事项材料制备时，最好使用新鲜材料，冷冻保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA，选择有核细胞(白细胞)组织培养细胞培养的时间不能太长，否则会造成DNA降解，液体材料中含有的病毒DNA含量较少，提取前浓缩，4。注意事项细胞裂解，材料应合适。太多会影响裂解，导致少量和低纯度的DNA。对于不同的材料，选择合适的裂解预处理方法：当植物材料-液氮研磨动物组织-匀浆或液氮研磨组织培养细胞-蛋白酶K细菌-溶菌酶破壁酵母-破壁酶或玻璃珠在高温浴中，它们会以一定的间隔轻轻振荡。4.注意事项：核酸被分离和纯化。当通过吸附材料的吸附来分离DNA时，当使用有机(苯酚/氯仿)萃取时，应提供相应的缓冲系统并充分混合，但当通过温和离心来分离两相时，应确保一定的转速和时间。根据不同物料的特点，萃取过程应辅以相应的除杂方法。第四，注意事项核酸应沉淀和溶解。当沉淀时间有限时，应使用预冷的乙醇或异丙醇进行沉淀。当沉淀更加充分沉淀时，加入1/10体积的NAAC (pH 5.2，3m)，有利于沉淀充分沉淀后用70%乙醇洗涤，以去除盐离子等。干燥脱氧核糖核酸，让乙醇完全挥发(不要过度干燥)。如果建议将乙二胺四乙酸溶于含乙二胺四乙酸的缓冲溶液中长期保存，乙二胺四乙酸可螯合Mg2或Mn2离子，并将脱氧核糖核酸的等电点值抑制在8.0，可防止脱氧核糖核酸酸解。含有蛋白质、多糖和多酚杂质的DNA在溶解前有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应的DNA中的金属离子，再次纯化DNA，除去蛋白质、多糖和多酚等杂质，再次沉淀DNA，使酒精充分挥发，增加70%酒精洗涤次数(2-3次)，5。DNA提取中的常见问题，问题1:不纯的DNA样品抑制了随后的酶解和聚合酶链反应。原因、对策、材料不新鲜或反复冻融不能很好地抑制内源核酸酶的活性。提取过程太严格了。DNA被外源核酸酶机械中断和污染。应进行反复冻融。新鲜的材料应该尽可能多。材料的冷冻保存应避免液氮研磨或组织匀浆后的反复冻融。解冻前应加入裂解缓冲液。从富含内源核酸酶的物质中提取DNA时，可增加裂解物中螯合剂的含量。细胞裂解后的后续操作应尽可能温和。所有试剂都应该用无菌水制备。消耗品应在高温下灭菌，以将DNA储存在缓冲溶液中，避免反复冷冻和解冻。问题2:脱氧核糖核酸降解，对策，原因，5。DNA提取中的常见问题、实验材料质量差或数量少导致的DNA损失、裂解导致的破壁或不完全沉淀以及不完全洗涤。新鲜的(年轻的)材料，如动物和植物，应尽可能均匀化和充分研磨。在裂解之前，通过生物酶或机械方法在高温下裂解细菌和酵母，并适当延长低温沉淀的时间(动物细胞和细菌的