第五章-酶与细胞的固定化不考PPT课件

.,1,第五章酶与细胞的固定化,游离酶使用中的局限性:,1.提取纯化繁琐,价格昂贵2.难以重复使用3.稳定性差,.,2,克服游离酶缺点的方法:,1.人工合成酶,使用有机合成以及聚合物化学中的最新技术来合成具有像酶那样活性的催化剂。,2.酶的改性、修饰,凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶都称为固定化酶。通过适当方法制成的不溶于水的酶都能满足这一定义。,.,3,第一节酶与细胞的固定化方法,一.固定化酶与细胞,定义：固定化酶或细胞是被限制或固定在某一局部的空间或特定的固体载体上并能发挥作用的一类酶或细胞。,.,4,(1)氨基酸生产，利用固定化细胞生产L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸。(2)抗生素生产，用固定化细胞生产杆菌素、四环素、头孢菌素等。(3)利用固定化细胞生产单克隆抗体、生长因子等、活性蛋白质药物、还可生产维生素B、维生素C中间体、山梨糖、氢化可的松等维生素和甾体激素系物质。,应用：,.,5,二固定化方法,酶的催化活性主要依赖于它的特殊的高级结构活性中心。因此在制备固定化酶时必须严格操作条件，尽可能避免酶的高级结构受到损害。,酶的固定化方法：,吸附法、包埋法、交联法、化学共价法以及酶的逆胶束包囊法。,.,6,吸附法,原理：将酶液或细胞悬浮液吸附结合到吸附剂表面。,蛋白质与载体之间的结合力相当弱。而且在很多情况下、酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活，高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附。因此，当要求的固定绝对牢固时，采用吸附法是很不可靠的。,可分为物理吸附法和离子交换吸附法。,.,7,酶的吸附剂,各种矿物质和其他无机载体（如：高岭土、皂土、氧化铝、氧化铁,氧化钛、磷酸钙凝胶）纤维素粉,例如高岭土能吸附胰凝乳蛋白酶，皂土能吸附过氧化氢酶和-淀粉酶，磷酸钙凝胶能吸附亮氨酸氨肽酶、淀粉酶，多孔玻璃能吸附胰蛋白酶，核糖核酸酶，能吸附葡萄糖氧化酶，覆盖有卵磷脂或脑磷脂的二氧化硅能吸附酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖变位酶等。,纤维素粉也可以作为吸附剂，酶蛋白主要吸附在纤维素微晶结构发生部分断裂的表面处。糖苷水解酶在纤维素上有较强的吸附，这可能是由于纤维素的多糖结构与这些水解酶的底物(糖类物质)结构有些相似的缘故。,目前最常用的吸附剂是离子交换剂。,如，羧甲基纤维素、DEAE纤维素，DEAE葡聚糖以及合成的阴离子和阳离子交换剂。多糖类离子交换剂的蛋白质结合量很高，达到50150mg酶蛋白/g载体。,离子交换剂对酶的吸附主要靠静电吸引力。缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时,这种结合发生分解。,考虑到生物体内酶的天然环境主要是由蛋白质组成，因此，人们尝试用蛋白质做载体固定所需的酶。最常用的蛋白质载体是胶原蛋白。,.,8,一般胶原蛋白载体预先制成膜状(胶原膜)，胶原膜溶胀、然后浸入酶溶液，酶渗入膜内并被吸附，制成酶膜。也可以通过含有酶的胶原分散液进行电沉积制得。由这些方法制得的两膜每克胶原可含有550mg酶。,具体方法,.,9,2.包埋法,原理：将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法称为包埋法。酶被包埋后不再扩散到周围介质中去而底物和产物却能自由扩散。,优点:具有普适性,酶在包埋过程中其分子本身并不直接参加反应，除了包埋过程中的化学反应可能对酶有不利影响或者作为包埋材料的聚合物会引起酶的变性外，基本上大多数酶都能用包埋法固定。,条件较温和、酶活力回收较高。,.,10,缺点:包埋法对底物分子和产物分于的大小有所限制。当底物和产物的相对分子质量小时，则扩散阻力小。,常用的格子型包埋法载体有：海藻酸盐、K角叉菜、琼脂、三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶等。,.,11,海藻酸盐包埋酶或细胞的一般操作方法,先将海藻酸盐溶于水中，使其具有一定黏度，然后加入一定量的细胞菌体达到0.3克湿菌体毫升左右，并且充分搅拌，使之分散均匀，通过注射器或毛细管将此菌体悬浮液注入含有Ca2+、Zn2+、Al3+等多价离子的溶液中，由于离子转移的胶凝作用海藻酸盐液滴便形成珠状的固定化细胞颗粒。待颗粒经过一定时间的硬化后洗净，即可用于催化反应。,.,12,缺点:,其一,在高浓度的电介质(K+、Na+)等溶液中，固定化颗粒会变得不稳定；其二,Ca+等多价离子在磷酸缓冲液中会沉淀，固定化颗粒的机械强度将降低，最后重新溶解。因此，用海藻酸盐包埋的固定化酶或细胞不能用于磷酸缓冲溶液中。,优点：,海藻酸盐价格便宜、来源丰富又无毒性，且操作简便、条件温和，目前仍是应用较广的包埋载体之一。,.,13,（2）K-角叉菜糖包埋法,K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物.在K+离子存在下，它能立即生成凝胶.,缺点：,对高浓度的Na+离子敏感固定化温度高,需要在3755。,.,14,（3）聚丙烯酰胺凝胶,方法：在含酶(或细胞)的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和交联剂N，N甲撑双丙烯酰胺。然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引发剂(过硫酸钾)的作用下低温(冰浴)聚合。产生的聚合物凝胶便是固定化酶，它可通过机械方法分散成一定大小的粒子以供应用。,优点：用聚丙烯胺凝胶包埋酶，其蛋白质的固定量较高，可达10-100mgg单体。,缺点:丙烯酰胺对酶具有变性作用,.,15,调节单体和交联剂的用量可以改善聚丙烯酰胺凝胶的渗透性。在单体丙烯酰胺浓度不变时，交联剂用量以5为最好。此时，凝胶的有效孔径最小，因而渗透性最小。如交联剂含量高于5，渗透性反而增加，不利于酶的固定。这现象可能是由于聚合时一些线性纤维被堆积成为一股股的纤维束，因而纤维束之间的距离变宽。如果单体浓度增加则被包埋的蛋白质的量将增加。但是，当单体浓度高于15时，被包埋的酶的活性却急剧下降。这显然是因为丙烯酰胺对酶起着变性剂的作用。,.,16,3.交联法,原理：交联法是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶发生分子间交联因而得到固定的方法。,常用的试剂：戊二醛、16亚己基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯马来酸酐共聚物等。,例如：戊二醛可直接参与酶蛋白的文联或者酶蛋白分子与其他惰性蛋白分子的交联，便形成酶的蛋白质聚结态。戊二醛也可以先与含伯胺的聚合物缩合形成多醛基聚合物载体。,缺点：双功能基团试剂与菌蛋白的交联作用，常引起蛋白质高级结构的改变，使酶失活。,常在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白，避免或减少菌在交联过程中因化学修饰造成的失活。例如牛血清蛋白和明胶等蛋白质的加人往往能够提高固定化酶的稳定性。,.,17,4.化学共价法,原理：共价法就是使非水溶性载体与酶以共价键的形式结合。,优点：用共价法固定酶，载体与酶的结合牢固、半衰期较长。,缺点：由于化学共价法结合时反应剧烈，常常引起酶蛋白高级结构发生变化，因此一般活性回收较低。,.,18,能够用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团有：,1.氨基-赖氨酸上的-氨基以及多肽链N末端氨基酸上的-氨基;2.羧基-双羧基氨基酸:门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧基,以及多肽链末端的-羧基;3.酪氨酸上的苯酚环;4.半胱氨酸上的巯基;5.羟基-丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上的羟基6.组氨酸上的咪唑基;7.色氨酸上的吲哚基其中以氨基和羧基为最常用,.,19,对于共价偶联反应的选择一般应考虑到酶蛋白上供共价结合的功能基团必须不影响酶的催化活性；反应条件必须尽可能温和；而且最好能在水溶液中进行反应。偶联反应应该对酶蛋白上某一类功能基团有很高的专一性，而对其他功能基团或水溶液几乎无副反应。,共价法的主要方法：酰化反应、芳化和烷基化反应、溴化氰法、重氮化反应以及硅烷基化法等。,.,20,A酰化反应,酶蛋白上的氨基能够与含有酰化基团，如酰化叠氮、酸酐等聚合物发生偶联，从而使酶固定。,.,21,B芳化和烷基化反应酶蛋白与某些含有卤代芳环或者卤代杂环的聚合物相互作用，酶蛋白上的氨基通过芳化而偶联。芳化聚合物为3氟-4，6二硝基苯基时,.,22,C溴化氢法在碱性(PH10.0一11.5）下用溴化氰使多糖类物质活化形成环化的亚氨碳酸盐，然后此活性聚合物能在温和的PH下与酶蛋白中氨基偶联并使酶固定；,偶联反应通常产生三种不同的结构,1)在N位与酶偶联的氨基甲酸酯，2)N位与酶偶联的亚氨碳酸酯，3)N位与酶偶联的异脲。,.,23,D重氮化反应带有芳氨基侧链的聚合物用亚硝酸处理后可以得到含芳香族重氮化基团的活性载体当这种活性载体与酶在pH89下作用时，通过酶蛋白酪氨酸残基上的酚羟基以及组氨酸残基上的咪唑基发生偶联，形成相应的偶联化合物，从而使酶固定。,.,24,5.逆胶束酶反应系统,除了用固体作载体将没固定外，近来利用逆胶束菌没没酶反应系统进行有机相合成反应生产具有工业意义的有机化合物已成为一种重要的酶技术。在这种系统中，酶以逆胶束的形式被“固定”，并在有机溶剂中参与反应。因此与过去认为酶只能在水溶液中进行反应的传统观点相反，逆胶束酶作为有机相反应的催化剂大大扩大了酶的工业应用。1969年日本千烟一郎等通过离子交换法将氨基酰化酶固定在DEAE葡聚糖载体上，从而制得了世界上第一个适用于工业生产的固定化酶。他们制得的固定化氨基酰化酶活性高，稳定性好，可用于连续拆分酰化DL氨基酸。,.,25,第二节固定化酶和固定化细胞的应用,一.利用固定化氨基酰化酶生产L氨基酸,1.氨基酸的应用：,目前氨基酸在医药、食品以及工农业生产中的应用越来越广。以适当比例配成的混合液可以直接注射到人体内，用以补充营养，各种“必需氨基酸”对人体的正常发育有保健作用。有些氨基酸可以作为药物治疗某些特殊疾病。氨基酸可用作增昧剂，增加香味，促进食欲；可用作禽蓄的饲料；可用来制造人造纤维、塑料等。因此氨基酸的生产对人类的生活具有重要意义。,2.工业上用化学合成法生产L-氨基酸,工业上生产L氨基酸的一种方法是化学合成法。但是由化学合成法得到的氨基酸都是天光学活性的DL型外消旋混合物，所以必须将它进行光学拆分，以获得L型氨基酸。外消旋氨基酸拆分的方法有物理化学法、酶法等，其中以酶法最有效，能够产生纯度较高的L氨基酸。,.,26,3.游离酶进行分批式水解在工业上的缺点：,1)溶液中游离酶的存在给产物L氨基酸的分离带来困难因此L氨基酸的得率较低。2)反应后的酶难以回收使用。3)分批式操作劳动强度大。,.,27,4.固定化酶的应用,利用固定氨基酰化酶拆分DL-氨基酸是固定化酶在工业上的第一项应用，我国研制的固定化酶不仅可拆分天然蛋白组分-氨基酸、而且还可拆分其他-氨基酸，例如可拆分乙酰-DL-氨基丁为生产乙胺丁酸酸。,.,28,二.在抗生素生产方面的应用,1.生产青霉素G,将青霉素G酰化酶采用包埋法或交联法进行固定来生产青霉素G。也可将含有青霉素G酰化酶的大肠杆菌细胞直接固定在载体上来生产青霉素G。,2.生产头孢菌素,.,29,三.生产葡萄糖和果葡糖浆,固定淀粉酶、糖化酶来生产葡萄糖（用于医药）,葡萄糖的甜度仅有蔗糖的74%，但其异构体果糖的甜度为蔗糖的173.3%。,利用微生物的葡萄糖异购酶可将葡萄糖异构化，得到40%-50%转化率的果葡糖浆（葡萄糖和果糖的混合物）。如：