细胞总蛋白提取及讨论

细胞总蛋白提取细胞处理后，弃去培养液；用4预冷PBS洗1遍，吸水纸吸取残留的PBS；加入冰上预冷的蛋白裂解液100l 【配方：RIPA裂解液 1ml + PMSF工作液(10mM) 10l + 正矾酸钠(2mM) 10l】，使之均匀平铺于细胞面，反复吹打，冰上静置30min；用细胞刮刀将细胞刮于培养皿一侧(显微镜下观察确认)，收集至预冷1.5ml EP管中，超声破碎细胞1min，静置5min，使细胞充分裂解；4，12000r离心15min；取上清液至另一1.5ml EP管，置于冰上分装2l用于BCA法测定蛋白质浓度，其余处理后保存备用或直接上样。细胞总蛋白的提取及裂解液一悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中，加入饱和浓度一抗(1/10)或（10ug/ml）415-30min后，短暂离心4000 转3分，用PBS 0.4-0.5ml重悬(室温),加入饱和浓度二抗（1/100）或 (20ug/ml),迅速置于37水浴中2-5分后（迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4,5mM EDTA,10mM NaF）,离心4000 转3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度108/ml？)吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细胞溶解成分。二裂解缓冲液：50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4150-300mM NaCl1(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100)5mM EDTA（现加1ml加10ul）临用前加入蛋白酶抑制剂：Na3VO4钒酸钠 1mM (75mM13.3ul/ml)（用0.2mol/L储存液配制）PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul）Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml（10ul/ml）(Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting三给你介绍一个裂解液：50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含：NaCl 150mM叠氮钠 0.02%SDS 0.1%NP-40 1%PMSF 100ug/ml（使用前临时加入）(10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS 上样buffer。四我的样品蛋白是这样制备的：将与腺病毒转染液共培养小时的细胞消化下来离心收集细胞向离心管里加入微升PBS 缓冲液，随后再加入微升2Lamilybuffer （由tris碱和SDS 组成）裂解细胞将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心测定蛋白浓度，加样电泳我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白胶的浓度应该没问题。五碧云天公司技术支持Western 及IP 细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1%Triton X-100，以及焦磷酸钠, -glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。(-20保存，一年有效。)如果是贴壁细胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量的1/20）加入裂解液。六军科院技术支持裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100ug/mlPMSF）：1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸馏水至 50ml混匀后， 4保存。使用时，加入PMSF 至终浓度为100ug/ml（0.87ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。七操作方法：蛋白样品制备：（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于 4度下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于20 度保存。 讨论版我以前做蛋白大量表达超声破碎时，总体积为200ml，功率300瓦，超3秒，停3秒，60次为一个循环，每个循环之间停5min，共作了3个循环，效果很好。不知你的“原来的80倍”是多少，如果和我的差不多，是要延长总时间，但要注意样品要放在冰上，中间停一会，防止产生的热量太多，使蛋白变性。我的方案是：1细胞先用无菌PBS洗二次；2吹下细胞后，4度12000rpm/min离心10min，再用无菌PBS悬浮，重复离心一次；3常规超声波处理。注意事项：1全部处理过程一定要在冰上进行；2超声波时，一定不要有泡沫产生；3在冰上超声波处理。由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料，汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方，希望能对其它求助兄弟有所帮助。菌体/细胞裂解法汇总一、反复冻融法：1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。/c?word=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A/www%2Ebioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/80878%2Ehtml&b=0&a=3&user=baidu2、至少3次以上冻溶。/bbs/actions/archive/post/_0.html3、IFCC推荐法：收集细胞悬液，4低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。/bbs/actions/archive/post/_0.html4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=&replyID=&skin=1二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。/bbs/actions/archive/post/_0.html2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。/bbs/actions/archive/post/_0.html3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。/bbs/actions/archive/post/_0.html4、综合冻融和超声的方法：1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。可选择：4下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4下g60min离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol三、渗透法：冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。精编分子生物学实验指南四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。/bbs/actions/archive/post/_0.html2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。/bbs/post/view?bid=65&id=&sty=3&keywords=SDS+%C1%D1%BD%E23、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。/bbs/actions/archive/post/_0.html4、20毫升细胞裂解液配方:40 L 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。/bbs/actions/archive/post/_1.html5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不就可以了吗？/bbs/actions/archive/post/_0.html6、将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2上样缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。/bbs/post/view?bid=65&id=&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#7、检测蛋白诱导：从培养的不同时期各取出1ml，12000g1min离心。将沉淀重悬于100ul 1SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2SDS，0.1溴酚蓝，10甘油）中，100加热3min，然后12000g1min离心。上样15ul，6SDS-PAGE电泳。分子克隆P8268、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2SDS上样缓冲液（100加热）。迅速混匀后100加热3-5min。将样品冰上放置（或-20放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。2SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2（w/v）DTT，8SDS，0.002（w/v）溴酚蓝，40甘油。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.59.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。/c?word=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A/www%2Ebioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/80878%2Ehtml&b=0&a=3&user=baidu10、我们用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放3060min，然后13000rpm离心15min，取上清定量。/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=&replyID=&skin=111、裂解液配方是：50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0. 02% 叠氮钠，100g/ml PMSF，1g/ml Aprotinin，1% Triton X-100 ( or NP-40)。/bbs/actions/archive/post/_0.html12、对于组织培养中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂（表面活性剂）进行处理，溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100g/ml PMSF、1g/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ，这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。/bbs/actions/archive/post/_0.html13、细胞裂解液的主要目的：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系），150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 g/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂），5 g/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。/bbs/actions/archive/post/_0.html14、裂解buffer：50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT（还原剂），7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mM EDTA(金属鏊合剂），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制剂），50mM NaF(ph7.0)（anti hemoaggulating），1mM Na3VO4(ph7.0)（inhibitor of phosphatases），2mM benzamidine（inhibitor of trypsin）。/bbs/actions/archive/post/_0.html15、可选择：取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清，用100ul 1SDS上样