微生物学实验PPT课件

江苏师范大学生命科学学院卓培班微生物学实验吕爱军2013年3月,1.培养基的制备及高压蒸汽灭菌2.器皿的清洗包装及干热灭菌3.实验室环境和人体表面微生物的检查4.无菌接种技术,基础综合实验一,培养基配方：,牛肉膏蛋白胨固体培养基：加1.5-2琼脂400ml牛肉膏蛋白胨培养基：液体培养基200ml,牛肉膏0.3g蛋白胨1gNaCl0.5g琼脂2g水100mlPH7.2-7.4,1.培养基制备及高压蒸汽灭菌,(1)培养基的配制：先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。操作图示：,称量-溶解-调节pH值-过滤-分装及包扎-灭菌-灭菌后试管摆放斜面、倒平板,(2)高压蒸汽灭菌一般培养基用0.1Mpa，121.5,1530min实验步骤：,加水,装待灭菌物品,加盖,加热,灭菌时间到后断电源,压力降为零开箱取物,摆斜面,倒平板将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15ml，摇匀，凝固，制成平板。,2.器皿的清洗包装及干热灭菌,(1)培养皿、三角锥瓶、试管的包扎,(2)干热灭菌法所需温度(160-170)，时间长(1-2h)。实验步骤:,恒温,降温,开箱取物,升温,装入待灭菌物品,(1)写标签：在皿底上(2)接种环境或体表微生物手指（洗前后）、头发、咳嗽、抹布、空气、硬币等(3)培养：37培养24h-48h,3.实验室环境和人体表面微生物的检查,常用的几种方法如下：斜面接种液体接种平板接种,4.微生物接种技术,1)斜面接种示意图,2)平板划线法：将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将接种环通过稍打开皿盖的缝隙（约30）伸入平板，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。,1.细菌的单染色2.革兰氏染色芽孢染色4.酵母菌形态观察、死活细胞鉴别,基础综合实验二,现场演示,1.细菌的单染色,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。,显微镜保养和使用中的注意事项,显微镜操作,1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3.换片：另换新片，必须从第一条开始操作。4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量去污剂擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。注意：油镜使用完毕后一定要用去污剂擦拭镜头,（1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。,制片初染（结晶紫1min）水洗媒染（碘液1min）水洗脱色（乙醇20-30s）水洗复染（番红2min）水洗干燥观察,2.革兰氏染色,3.芽孢染色法(1)取37培养1824h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。(2)于载片上滴入35滴5孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约45min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用0.5沙黄水溶液(或0.05碱性复红)复染1min，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。,制片染色（孔雀绿5min）水洗复染（蕃红花红2-3min）水洗干燥镜检,芽孢染色,切勿煮干,在载玻片中央加一滴0.1吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均匀；,用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上；,4.酵母菌形态观察、死活细胞鉴别（美蓝浸片）,染液不宜过多或过少,盖玻片不宜平着放下,将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细