微生物-八遗传3

基因突变和诱变育种,第三节,一、基因突变（genemutation）,一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,简称突变，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。,突变几率一般很低（10-910-6）,狭义的突变：专指基因突变（点突变）,广义的突变：包括基因突变和染色体畸变,从自然界分离到的菌株，简称野生型。,野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株,又称突变体或突变型。,突变株（mutant）,野生型菌株（wildtypestrain）,（一）突变类型,凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。,选择性突变株（selectablemutant）,非选择性突变株（non-selectablemutant）,反之。,突变株的表型,非选择性突变株,选择性突变株,抗性突变型（株）,营养缺陷型（株）,条件致死突变型（株）,形态突变型（株）,抗原突变型（株）,产量突变型（株）,1.营养缺陷型（auxotroph）,某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型。,营养缺陷型突变株在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中十分重要,表型判断的标准：,在基本培养基上能否生长,营养缺陷型的表示方法：,基因型：,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）,表型：,同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC,影印平板（Replicaplating）法用于营养缺陷型突变株的分离，由Lederberg夫妇在1952年建立。,2.抗性突变型（resistantmutant）,指野生型菌株因发生基因突变，使菌株对某化学药物或致死物理因子，特别是抗生素，产生抗性的变异类型。,特点：,正选择标记突变株可直接从抗性平板上获得在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变株能生长。所以很容易分离得到。,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示。,抗性突变菌株在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中极为重要,3.条件致死突变型（conditionallethalmutant）,某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。,在25下可感染其E.coli宿主在37却不能感染,Ts突变株即温度敏感突变株（temperaturesensitivemutant，Tsmutant）是一类典型的条件致死突变株。,E.coli的Ts突变株,在37下正常生长在42下不能生长,T4噬菌体Ts突变株,产生Ts突变的原因,在某特定的温度下具有功能,在另一温度（一般为较高温度）下则无功能,突变使某些重要蛋白质的结构和功能发生改变，,4.形态突变型（morphologicalmutant）,指由于突变而引起的个体或菌落形态的非选择性变异。,5.抗原突变型（antigenicmutant）,指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生变异的类型，一般也属非选择性突变。例如，细胞壁缺陷变异（L型细菌等）、荚膜或鞭毛成分变异等。,6.产量突变型（metabolitequantitativemutant）,通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株，称为产量突变型。,筛选高产正变株的工作对生产实践极其重要,在育种实践上,诱变育种重组育种遗传工程育种,（二）基因突变的特点,7个共同点,（1）自发性,（2）非对应性,（3）稀有性,（5）可诱变性,（4）独立性,（7）可逆性,（6）稳定性,（1）自发性,各种性状的突变，可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。,（2）非对应性,突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。,这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题,（3）稀有性,自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在10-910-6间。,若干细菌某一性状的突变率,突变一般是独立发生的。,某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。,同一细胞中同时发生两个基因突变的几率是各个基因突变几率的乘积。,某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。,（4）独立性,（5）可诱变性,自发突变的频率可因诱变剂（mutagen）的影响而大为提高（10105倍）。,基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。,（6）稳定性,回复突变，也称回变（reversemutation或backmutation）,（7）可逆性,野生型菌株,突变株,（forwardmutation）正向突变,（三）基因突变的分子基础,基因突变机制的多样性：,点突变：DNA的微创畸变：DNA的大创伤,自发突变诱发突变,影响一对碱基的突变,影响一段染色体的突变,1.自发突变（spontaneousmutation）,自发突变（spontaneousmutation）是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。,自发突变的原因,（1）背景辐射和环境因素,（3）DNA复制过程中碱基配对错误,（2）微生物自身有害代谢产物,一个1000bp的基因自发突变频率约为10-6,例如，过氧化氢等,例如，天然的宇宙射线等,(1)碱基的置换（substitution）,碱基的置换只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于典型的点突变（pointmutation）。,碱基互变异构体的存在是碱基置换发生的最主要原因。,T在一般情况下以酮式结构存在，但是在极少数的情况下，分子中N5位上的H能转移到C6上，从而使酮式转变为烯醇式，但是极快地通过H的移位，烯醇式又可恢复到酮式。,这种碱基分子结构上的相互转变称为互变异构。,由于互变异构，胸腺嘧啶本来与腺嘌呤（A）配对，但在转变为烯醇式的一瞬间，如果刚好DNA进行复制，T就不再与A配对而与G配对。这样，当DNA再次复制时，通过G和C配对，就使A：T转变成GC。而GC将是一个突变体。,由于4个碱基均能以异构型存在，所以在DNA复制过程中，一个嘌呤可以被另一个嘌呤所替换，同样一个嘧啶也可被另一个嘧啶所替代;或者嘌呤被嘧啶、嘧啶被嘌呤所替代。,-碱基置换,碱基的置换,转换（transition）,颠换（transversion）,一个嘌呤,另一个嘌呤,一个嘧啶,另一个嘧啶,一个嘌呤,一个嘧啶,碱基置换引起的突变,(2)移码突变（frame-shiftmutation，phase-shiftmutation）,指诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生插入或缺失，从而使其后面的全部遗传密码的阅读框发生改变，并进一步引起转录和翻译错误的一类突变。,由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shiftmutant）。,DNA分子的微小损伤,点突变,（3）染色体畸变：缺失、插入、重复、易位、倒位,诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因突变频率的手段。,2.诱发突变（inducedmutation）,凡具有诱变效应的任何因素，都称诱变剂（mutagen）。诱变剂的种类很多，主要包括物理因素和化学因素。,嘧啶（敏感性）嘌呤,紫外线（ultravioletray，UV）,嘧啶二聚体（TT，TC，CC）和水合物,（1）物理因素：,DNA对紫外线具有吸收能力,大剂量作用可致菌体死亡,小剂量则可引起突变.,（2)化学诱变剂,常用的化学诱变剂有碱基结构类似物、亚硝酸、羟胺、烷化剂等。,(a)、碱基类似物的代谢掺入,5-溴尿嘧啶（5-BU）:这是一种能增加碱基对置换机率的化学诱变剂。5-BU由于在结构上与碱基胸腺嘧啶（T）相类似，因此称为碱基类似物。,由于5-BU在结构与T相类似，因此当微生物在含有5-BU的培养液中生长并合成DNA时，能以5-BU代替T，并且与A配对，通过代谢掺于到DNA分子中，从而引起碱基对的转换。5-BU掺入DNA这对细菌来说并无影响，问题在于5-BU也有酮式和烯醇式两种结构，并且出现烯醇式的频率更高，这样也就增加了A：TGC的机率。,象5-BU这类碱基代谢类似物既可造成突变又可产生回复突变。回变的概率与突变概率相等。,（b）亚硝酸：,亚硝酸是一类对含有氨基的碱基序列直接起作用,而诱发碱基对置换的化学诱变剂。亚硝酸的作用是使DNA碱基中的氨基氧化脱氨，脱去的氨基被羟基取代，这样就使腺嘌呤（A）转变成次黄嘌呤（H）、胞嘧啶（C）转变成尿嘧啶（U）。而当AH和CU后，由于H和C配对，U与A配对，因此，当DNA再次复制时，A：TGC而GCA:T,转座因子,插入序列（insertionsequence，IS）,转座子（transposon，Tn）,Mu噬菌体（mutatorphage）,转座噬菌体（transposablephage）,原核生物,E.coli,（3)生物诱变因子,若干诱变剂的作用机制及诱变功能,把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。,光复活作用（photoreactivation，photorestoration）,（四）突变的修复,E.coli的实验对照：8106个mLE.coli100个mLE.coli试验：8106个mLE.coli2106个mLE.coli,UV,UV,360490nm,可见光，30min,使二聚体（dimer）重新分解成单体（monomer）,带有嘧啶二聚体的DNA分子,DNA分子,UV照射,黑暗下结合,光激活酶光解酶（光裂合酶，photolyase）,复合物,300500nm可见光获得光能而激活,释放光解酶,光复活作用,2.切除修复（excisionrepair）,是活细胞内一种用于修复被UV等诱变剂（包括烷化剂、X射线和射线等）损伤后DNA的方式之一，又称暗修复（darkrepair），通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。,酶切,合成,切开,切除,聚合,连接,3.重组修复：4.SOS修复：,课本P273,二、诱变育种,诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,筛选,诱变,诱变育种,定向的更重要,随机的,可获得供工业和实验室应用的各种菌株；提高有用代谢产物的产量；减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。,诱变育种具有重大的实践意义,出发菌株,纯化，同步培养,培养液,离心，洗涤，打散,细胞或孢子悬液,诱变处理,平板分离,初筛,复筛,保藏及扩大试验,活菌计数,存活细胞计数，致死率计算,变异率计算,1.诱变育种的基本环节,化学诱变剂,非电离辐射类,引起电离辐射,烷化剂碱基类似物吖啶类化合物,物理因素,（1）选择简便有效的诱变剂,X射线射线快中子等,紫外线激光离子束等,2.诱变育种几个原则,烷化剂可与巯基、氨基和羧基等直接发生反应，更易引起基因突变。,最常用的烷化剂N-甲基N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亚硝基脲（NMU）、硫酸二乙酯（DES）、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。,拟辐射物质,氮芥、硫芥和环氧乙烷等,各种点突变,一般只有辐射才能诱发,染色体畸变,诱发,出发菌株（originalstrain）是指用于育种的原始菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率。,（2）挑选优良的出发菌株,合适的出发菌株来源：由自然界直接分离获得的野生型菌株；在生产中经历生产条件考验的菌株；已经过诱变甚至多次改造的菌株；选用对诱变剂敏感性较高的增变变异株；等等。,在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。,（3）处理单细胞或单孢子悬液,因为:分散的细胞可均匀地接触诱变剂，,诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法在当代的表型上反映。只有经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，这就叫表型延迟(phenotypelag）。,表型延迟（phenotypelag）,诱变剂的作用有三条：一是提高诱变的频率二是扩大变异的幅度三是使变异向正变的方向移动（产量提高）,（4）选用最适的诱变剂量,凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。,通过比较上述两曲线，可找到某诱变剂的剂量存活率诱变率三者的最佳结合点。,诱变剂的复合处理常常表现出明显的协同效应，这对育种工作是有利的。,（5）充分利用复合处理的协同效应（synergism）,复合处理的协同效应,复合处理有几类：两种或多种诱变剂的先后使用；同一种诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的同时使用。,（6）设计高效筛选方案,设计简便、高效的科学筛选方案。,初筛,筛选工作,复筛,以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）,以质为主（精确测定潜力大的菌株的代谢产物量）,产量性状转化为与之相平行的肉眼可见的性状。快速平板检出法,提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，找到形态变异与产量变异两者间的相关性。,初筛,复筛,对产量突变株生产性能的测定方法,粗测为主,在培养皿平板上,较精确的测定,摇瓶培养台式自控发酵罐,在摇瓶中,3.突变株的筛选方法,（1）产量突变株的筛选,（2）抗药性突变株的筛选,（3）营养缺陷型突变株的筛选,（1）产量突变株的筛选,1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（kasugamycin）高产菌时所采用琼脂块培养法，一年内曾使该抗生素产量提高10倍。,此法的关键是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。数据精确，效率高,（2）抗药性突变株的筛选,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）,梯度平板法（gradientplate）定向筛选抗药性突变株通过制备存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后选取抗药性菌落等步骤，可定向筛选到相应抗药性突变株。,梯度平板法（gradientplate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。,（3）营养缺陷型突变株的筛选,营养缺陷型突变株（auxotrophicmutant）在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。,基本培养基（MM，符号为）,与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基,完全培养基（CM，符号为）,补充培养基（SM，符号为A或B等）,a.基本培养基（MM，符号为）,仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称MM。,b.完全培养基（completemedium，CM，符号为）,凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需