生物信息学序列分析生物信息学常用软件及其使用.ppt

一、DNA序列片断拼接（电子基因克隆）,获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有途径是寻找同源序列，标准：长度100bp，同源性50%以上、85%以下。然后将检出序列组装为重叠群（contig），以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠样系列，重复以上过程，直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时可获得全长的基因编码序列。再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如有精确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。,VectorNTI5.2中的contigExpressContigExpress软件：Sequencer软件：ftp:/,二、DNA序列测定图谱分析Chromas软件：.au/chromas230.exe,三、限制性核酸内切酶位点的分析,限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。即一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。,（一）定义：,其中的II类限制性核酸内切酶是重组DNA技术中的重要工具酶。II类酶识别序列特点为回文结构，大多为46bp回文结构（palindromesequence），如EcoRI识别序列：5GAATTC35GGATCC33CTTAAG53CCTAGG5,限制性核酸内切酶命名,Smith和Nathame命名原则（1973）属名+种名+株名+流水例如：流感噬血杆菌d株（Haemophilusinfluengaed）HindHindHindHind,常用的限制性核酸内切酶酶切序列,限制酶识别序列及切口限制酶识别序列及切口AluAG/CTHindA/AGCTTTC/GATTCGA/ABamHG/GATCCSalG/TCGACCCGAG/GCAGCT/GBglA/GATCTSmaCCC/GGGTCTAG/AGGG/CCCEcoRG/AATTCCTTAA/G,stickyend535353EcoRGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAG353535bluntend535353SmaCCCGGGCCCGGGGGGCCCGGGCCC353535,利用NEBLab在线免费软件分析：,DNAStar、DNAClub、DNATool等其他商业软件均能分析。以DNAClub为例说明。,四、PCR引物设计（包括杂交探针设计）,（一）引物设计的原则引物要跟模板紧密结合；引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在；引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。,引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，G值(internalstability)，引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin），错误引发位点（falseprimingsite），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。,（二）引物设计需要考虑的因素,（三）引物设计要点,一般引物的长度为15-30bp，常用的长度为18-24bp，过长或过短都不合适。引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物所对应模板序列的Tm值最好在72左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。,G值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。一般情况下，在Oligo5.0软件的G值窗口中，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间部分G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5端与中间段的G值应较高，而3端G值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。,可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。,推荐使用自动搜索软件（商业软件）：PrimerPremier5.0推荐使用引物评价软件（商业软件）：Oligo6网址：,（四）、引物设计软件的使用,OLIGO6.0PCR引物设计,设计引物的免费在线软件Primer3，网址:/primer3,我的评价：是非常优秀的设计引物的软件！是真正的“免费的午餐”！天上会掉下“馅饼”的?会的!,以一条序列为例，说明其使用方法,五、质粒绘图软件,Winplas（商业软件）pDRAW32软件（商业软件），其网址：http:/hjem.get2net.dk/acaclone，可以看到演示版和有关信息VectorNTI（商业软件）,Winplas2.6质粒构建,Plasmidprocessor其免费下载的网址http:/www.hytti.uku.fi/%7Eoikari/plasmid.htmlDMUPbeta其免费下载的网址,Plasmidprocessor质粒作图软件是压缩软件，需要先将其解压到一个目录下（不需安装即可直接应用），然后才能应用。（压缩文件是网络传输的最常用文件，目的是为了传输方便）；1）在资源管理器中双击Plasmid.exe文件（553kb)，进入作图的界面；2）点file-new,在出来的对话框中填上Plasmidname和length,比如分别填pBR322和4322（bp)（注意不能填4.322kb，否则软件不认识）。点击OK，进入下一个界面，上面是一个圆，标着pBR322和4322bp。3）点-date-restrictionsite加酶切位点，填酶的名称及定位；4）点Date-multiple-Genes,填基因名称（如E6），位点在500至890处，还是在此对话框中，选择右下角的style选所加基因的格式是箭头还是长的圆弧等格式（根据喜好），选厚薄度（thichness),然后点击此对话框右上部分的AddGene，在点击done，于是基因就加上了。基因和酶切位点可反复加多次。,5）但本软件缺陷之处上多克隆位点不能直接加，只能通过点-date-restrictionsite加酶切位点，在此对话框中加多克隆酶切位点（如加HinIII,EcoRI,BstI时，点-date-restrictionsite加酶切位点，出现对话框后，HinIII,location比如填1，-Addsite;EcoRI填3,-Addsite;Bst填5-Addsite;然后点击OK.在圆上将位点15处用鼠标往旁边分别一拖，就可看见这三个位点了。,质粒作图的在线软件PlasMapper2.0,http:/wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper,六、进化树分析软件,MEGA4.0：免费分子进化遗传分析软件免费下载地址:VectorNTI：商业软件,VectorNTISuit同源比较主窗口,VectorNTISuit同源比较进化树,七、序列的同源性分析软件,BlastClustalW,Blast简介,BLAST是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。BLAST是“局部相似性基本查询工具”(BasicLocalAlignmentSearchTool)的缩写。/BLAST/(网络版),主要的blast程序,举例说明使用过程,p1MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL