抗体制药part.ppt

,第五节抗体工程,一、1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体二、以1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表。三、以1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表四、1994年Winter创建了噬菌体抗体库技术,第五节抗体工程,抗体分类,多克隆抗体免疫动物单克隆抗体杂交瘤技术基因工程抗体噬菌体抗体库技术,第五节抗体工程,一、噬菌体抗体库技术的基本方法二、噬菌体抗体库技术的特点三、基因工程抗体的表达,第五节抗体工程,1.获取目的基因,一般都是从提取RNA经反转录PCR获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区（VH、VL）基因。抗体基因的组合形式多为单链抗体。,第五节抗体工程,2.抗体库技术的载体,现在普遍使用的噬菌粒（phagemid）载体，具有噬菌体和质粒的共同特点。抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在载体表面，再感染后，能使目的克隆得以扩增。,第五节抗体工程,3.淘筛,淘筛的基本过程是：抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后在感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，在反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，是目的克隆大量地扩增。,第五节抗体工程,4.表达与鉴定,目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用Westernblot分析确定后，完成全过程。,第五节抗体工程,遗传工程鼠,人抗体鼠：将小鼠lg基因灭活，然后转入人lg基因，生产出人单抗,第五节抗体工程,噬菌体抗体库技术,将抗体全套可变区间基因组装到噬菌体载体，并表达于噬菌体表面，所得到的多样性噬菌体抗体的集合，称为噬菌体抗体库。利用噬菌体抗体库，筛选并富集特异性抗体的过程，称为噬菌体抗体库技术。,第五节抗体工程,噬菌体抗体库的分类,按抗体基因的性质分1.DNA文库2.cDNA文库按抗体基因的来源分1.天然抗体库（nativeantibodulibrary）2.免疫抗体库3.半合成抗体库4.全合成抗体库,第五节抗体工程,噬菌体展示技术的原理,第五节抗体工程,噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连接在一起。,第五节抗体工程,选择方式：淘选（Panning）而不是筛选（Screening）,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,一、噬菌体抗菌库的构建,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,筛选流程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,二、噬菌体抗体库技术的特点,基因型和表型相统一选择能力和扩增能力相结合,第五节抗体工程,噬菌体展示技术最关键的优势有三：,第一，淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；第三，展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。,第五节抗体工程,噬菌体抗体库技术的优势,可实现单抗的小型化可实现单抗的多功能化简单易行、生产成本低、筛选容量大、可通过发酵生产、大量制备,第五节抗体工程,第五节抗体工程,三、基因工程呢抗体的表达,原核表达大肠杆菌真核细胞表达哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母转基因植物表达转基因动物表达,第五节抗体工程,抗体在体外人源化存在的问题,操作过程复杂需付出昂贵的代价抗体的亲和力降低抗体不是人体免疫系统天然产生异源抗体与免疫系统的配合,第五节抗体工程,最理想的单克隆抗体,100%人源人类免疫系统自然产生,第五节抗体工程,全人抗体的理论基础,癌症、病毒、细菌对机体而言均为异己物人体不断受异己物攻击，但免疫系统同城游清除能力免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物做出反应体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体,第五节抗体工程,全人抗体面临的关键问题,持续分泌抗体的人B细胞抗体分泌细胞的保持,第五节抗体工程,25年来的全人抗体的尝试,鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合稳定性差抗体产量低非洲淋巴细胞瘤病毒（EBV）保存抗体分泌细胞细胞株不稳定抗体的产量低不能特异性地保存抗体分泌细胞很难获得人类骨髓瘤细胞株,第五节抗体工程,全人抗体技术的最新突破,成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体进入新的里程,用途：能稳定的保持人B细胞分泌抗体的能力发明人：英国剑桥大学的DrKarpas教授意义：1.在整体水平研究人类产生的抗体2.开创人类抗体基因组学的研究评价：1.诺贝尔奖得主DrMilstein推荐发表在PNAS2.世界权威杂志“科学”发表了新闻评述3.剑桥大学开了新闻发布会,第五节抗体工程,人-人杂交瘤技术,开发针对未知抗原的全人治疗用抗体的唯一技术分离、保存稳定分泌天然抗体的B细胞先进方法寻找新型肿瘤相关抗原的捷径,第五节抗体工程,人-人杂交瘤技术的优势,迅速高效的生产天然人类单克隆抗体,抗原选定和抗体产生都由人类免疫系统完成，不会引起自身免疫反应，与人体免疫系统配合良好，能获得最佳亲和力和中和活性的抗体，更合理的自然选择药物设计方式，加速抗原的发现和抗体的开发过程。,第五节抗体工程,人-人杂交瘤技术的优势,简便、低费用的抗原抗体研究生产方式,与其他抗体改良技术相比操作更简便起始抗体分泌水平较高，可直接用于工业规模生产避免了改良技术引起的抗体失活无需发现抗原和对抗元进行功能确定,第五节抗体工程,人-人杂交瘤技术的优势,简便、低费用的抗原抗体研究生产方式,与其他抗体改良技术相比操作更简便起始抗体分泌水平较高，可直接用于工业规模生产避免了改良技术引起的抗体失活无需发现抗原和对抗元进行功能确定,第五节抗体工程,人-人杂交瘤技术的优势,唯一研究人抗体图谱的技术,确实人来免疫识别系统，确定人类免疫系统在不同的生理、病理以及发育条件下得到的抗体图谱。,研究癌症免疫学和抗原基因组的最新技术,寻找人类癌症抗原，将找到的抗原作为癌症疫苗和抗体药物开发的靶标,第五节抗体工程,人-人杂交瘤技术的优势,开发针对已知抗原的第二代全人抗体产品,如：HERE-2/neu、TNF、以及感染性疾病和乙型肝炎病毒、HCV和HIV,与其他细胞融合，产生杂交瘤，制造其他有用的人类蛋白质,第五节抗体工程,未来单抗开发的完美方案,从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体全人抗体挑战靶分子的筛选开发未知抗原的治疗用抗体,第五节抗体工程,人-人杂交瘤技术的优势,1.癌症：,抗肝癌单克隆抗体抗乳腺癌单克隆抗体抗肺癌单克隆抗体抗结肠癌单克隆抗体,2.病毒性疾病：,乙型肝炎病毒单克隆抗体丙型肝炎病毒单克隆抗体艾滋病病毒单克隆抗体,第五节抗体工程,需要整合的技术平台,蛋白组学蛋白芯片、蛋白矩阵、二维电泳技术免疫组学组织信息学细胞阵列技术组织微阵技术人-人杂交瘤,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第五节抗体工程,第六节抗体诊断试剂,一、抗体诊断试剂,抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈某些反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定，抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物。,第六节抗体诊断试剂,1.血清学鉴定用的抗体类试剂,血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌诊断和血型鉴定。常用的方法是凝集反应。,第六节抗体诊断试剂,1.血清学鉴定用的抗体类试剂,鉴定病原菌用的抗体试剂A、常用诊断血清的品种和用途B、诊断血清的制备步骤a、制备细菌抗原：细菌接种-培养-收集菌苔-制成菌液。b、免疫动物和制备抗体血清：动物：家兔、马、羊、豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下、接种次数37次，每次间隔37次，每次间隔34d，末次注射后68d取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。C、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应,第六节抗体诊断试剂,乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。B、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠-获得抗HBs血清-硫酸铵盐析/柱层析-取其lgG-在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞-洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。,第六节抗体诊断试剂,C、诊断方法：RPHA（reversepassivehemaggluti-nation），反向被动血凝反应）法。在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，许多血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。,第六节抗体诊断试剂,妊娠诊断试剂妇女妊娠后，血清和尿液中的HCG（humanchononicgonadotrop(h)in），人绒毛膜促性腺激素）含量增高，在3个月呢可达到高峰，此时检测尿液中的HCG，就可确定是否怀孕。抗ABO血型系统血清,第六节抗体诊断试剂,2.免疫标记技术用的抗体类试剂,给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高，结合显微技术，还可对抗原物质做出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制探讨发病机制提供手段。,第六节抗体诊断试剂,2.免疫标记技术用的抗体类试剂,荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素，如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原细胞物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。,第六节抗体诊断试剂,：免疫酶抗体诊断试剂：酶标诊断试剂HBsAg（乙型肝炎表明抗原）酶标诊断试剂HBeAg（乙型肝炎e抗原）酶标诊断试剂HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂,第六节抗体诊断试剂,：放射免疫用抗体诊断试剂把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。常用的标记抗体试剂：,第六节抗体诊断试剂,3、导向诊断药物,由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向性药物还未在临床广发使用,第六节抗体诊断试剂,二、抗体治疗药物,以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有20多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，受试病人超出数千例，但治疗用的制剂尚没有达到商品化的程度。在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅30%。目前的客