中国药品检验标准操作规程2010版--微生物限度检查法

中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法微生物限度检查法一、细菌、霉菌和酵母菌计数 简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在该规定条件下所生长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。2 设备、仪器2.1 设备2.1.1 洁净实验室微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。2.1.1.1 结构和要求 洁净实验室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。操作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。洁净实验室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LX。2.1.1.2 温度、湿度 洁净实验室内的温度应控制在1826，相对湿度最好在4060。2.1.1.3 操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于5Pa。操作台上备有药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。2.1.1.4 缓冲间 缓冲间内应有洗手盆和无菌衣、帽、口罩、鞋套等。2.1.1.5 洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法的现行国家标准）进行洁净度验证。不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准见下表1。表l 不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准洁净级别尘埃数m3浮游菌（个）m3沉降菌（个）（90mm0.5h）微粒直径0.5m微粒直径5m100级3，50005110000级350，00020001003级3，500，00020，00050010沉降菌数测定（法）洁净实验室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经3035预培养48h，证明无菌落生长）。以无菌方式（或经传递箱）移人操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在3035培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。有条件的单位，同时应检查洁净操作间和净化工作台上的浮游菌和微粒数。操作问和净化工作台要定期检测其洁净度，分别应达到10000级和100级。如菌落数或微粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤设施，必要时予以更换。2.1.1.6 在每次操作前、后用0.1苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，然后启动层流净化装置。2.1.2 阳性菌实验室涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等实验活动，应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外，阳性菌实验室应符合国家级生物安全标准，阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。2.1.3 洁净实验室、阳性菌实验室与洗刷、灭菌、消毒、培养及结果观察的工作间等设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.2 仪器2.2.1 恒温培养箱（3035）、生化培养箱（2328）、微波炉、匀浆仪（30008000 rmin）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（100300）、电冰箱、离心机、离心管、微孔滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。菌落计数器、显微镜（401500）、电子天平或药物天平（感量0.1g），pH计。2.2.2 玻璃器皿 锥形瓶（250300ml、500ml内装玻璃珠若干）、培养皿（9cm）、量筒（100ml，500m1）、试管（18mm180mm）及塞、吸管（1m1分度0.0l，10m1分度0.1）、注射器（20ml或30m1）、涂布棒、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160干热灭菌2h或高压蒸汽121灭菌30min，烘干备用。2.2.3 用具 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用7075乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。接种环（白铱金或镍铬合金，环径45mm、长度610cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。3 试液、稀释剂和试剂3.1试液3.1.1 0.1苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。3.1.2 5石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液。3.1.3 75乙醇溶液。3.1.4 碘酊或碘伏溶液。3.2 稀释剂和试剂稀释剂配制后，采用高压蒸汽灭菌法灭菌。3.2.1 0.9无菌氯化钠溶液（附件二3.1）。3.2.2 pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（附件二3.5）。3.2.3 无菌聚山梨酯80氯化钠蛋白胨缓冲液（附件二3.4）。3.2.4 pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（附件二3.3）。3.2.5 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液（附件二3.2）。3.2.6 无菌0.1氯化三苯四氮唑溶液（TTC）（附件二2.15）。3.2.7 pH7.2无菌磷酸盐缓冲液（附件二3.3）。4 培养基4.1 营养琼脂培养基（附件二5.2）。4.2 玫瑰红钠琼脂培养基（附件二5.4）。4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基（附件二5.5）。培养基制备注意事项：4.3.1 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。4.3.2 配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。4.3.3 培养基的分装量不得超过容器的23，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。4.3.4 培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。4.3.5 灭菌后的培养基应保存在225，防止被污染，可在3周内用毕；保存于密闭容器中，可在1年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。4.3.6 宜采用用水浴或微波炉加热熔化琼脂培养基，勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。已熔化的培养基应8h内一次用完，剩余培养基不宜再用。4.4 培养基适用性实验的要求及操作见本操作规程第三部分。5 供试品抽样、保存及检验量5.1 抽样5.1.1 一般采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的35倍量（以备复试或留样观察）。5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品。机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。5.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。5.2 保存5.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥致死，损伤或繁殖。5.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品进行检查。5.3 检验量5.3.1 所有剂型的检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸需取自4丸、膜剂取4片以上）。5.3.2 固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g。5.3.3 液体制剂检验量为10ml。5.3.4 膜剂除另有规定外，检验量为100cm2。5.3.5 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。6 试验准备6.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10m1）、量筒、稀释剂等移至洁净实验室内。每次试验所用物品必须事先做好计划，准备足够用量，避免操作中出入洁净实验室。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。6.2 开启洁净实验室空气过滤装置，并使其工作不低于30min。6.3 操作人员用肥皂或适宜消毒液洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。6.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。7 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。所用乳化剂，分散剂、中和剂或灭活剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45，时间不得超过30min。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：7.1 液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。7.2 固体、半固体或黏稠液供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。7.3 非水溶性供试品7.3.1 软膏、乳膏剂 取供试品5g（或5m1），加至含溶化的（温度不超过45）司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌混合物（溶化，温度不超过45）的烧杯中，即先将烧杯中无菌助溶剂混合物溶化，待温度不超过45时，加入供试品，用无菌玻棒搅拌成团后，分次慢慢加入45的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。7.3.2 油剂 取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯80 58ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml，作为1:10供试液。7.3.3 栓剂 称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯80 58ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100m1），摇匀，作为1:10供试液。7.3.4 膏剂 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录 H“无菌检查法”)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100m1，振摇510min，萃取，待油水明显分层，取其水层作为1:10供试液。7.4 非水溶性膜剂供试品 一般取样为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，于451水浴中保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为l:10供试液。中药膜剂取100cm2，剪碎，加适量的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（通常1 cm2加1ml或2m1），浸泡，振摇，以供试品浸液作为1:10供试液。75 肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，均置45水浴中，振摇，使溶解，作为1:10供试液。7.6 气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰箱冰冻室（20以下）内约1h。取出，迅速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的稀释剂（若含非水溶性成份，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。7.7 茶剂供试品 取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇23min，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1:10加稀释剂，浸泡30min）。以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释剂的量，制成1:201:100供试液。7.8 贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30min，或放置于均质仪均质l0min，或以其他方法制备成供试液。7.9 具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：7.9.1 稀释法 取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。7.9.2 离心沉淀法 此方法用于去除供试液中的沉淀物，对于抑菌活性较强的供试品，如供试液中有不溶颗粒、沉淀，取供试液，先以500 rmin，离心3min，取上清液进行试验，此方法用于细菌计数和控制菌（细菌）检查。7.9.3 薄膜过滤法 见细菌、霉菌和酵母菌计数。7.9.4 中和法 凡含汞、砷或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。8 供试液的释稀（10倍递增稀释法）8.1 取23支灭菌试管，分别加入9ml pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量。切勿在酒精灯火焰的正上方操作，以免火焰将供试液中的菌细胞杀灭）。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。8.2 另取1支1ml灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml，加入装有9ml pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂的试管中，混匀，即得1:100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:103、1:104等适宜稀释级。每递增l稀释级，必须另换一支吸管。稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。9 计数方法验证由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。9.1 验证用菌株大肠埃希菌Escherichia coli CMCC(B) 44102，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CCMCC(B) 26003，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC(B) 63501，白色念珠菌Candida albicans CMCC(F) 98001，黑曲霉菌Aspergillus niger CMCC(F) 98003。菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养1824h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养2448h。上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养57天，加入35ml含0.05（mlm1）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（mlml）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50l00cfu的孢子悬液。菌悬液制备后，若在室温下放置应在2h内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉菌的孢子悬液保存在28，可在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。9.2 验证方法 验证试验分4组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。9.2.1 供试品组 取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50l00cfu试验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液各1ml分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基；薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。9.2.2 活菌组 取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。9.2.3 供试品对照组 取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。9.2.4 稀释剂对照组 为考察供试液制备过程中对微生物影响的程度，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml含50l00cfu，按供试品组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。9.3 结果判定对照组的菌回收率均应不低于70。若供试品组的菌回收率均不低于70，则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中供试品组的菌回收率低于70，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。9.4 验证试验可与供试品的细菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。9.5 注意事项9.5.1 所用标准菌种的传代次数不得超过5代。以冷冻干燥的原始菌种开启后转种培养，其培养物为第一代。9.5.2 黑曲霉菌的菌液制备 将黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，于2025培养57天，使大量的孢子产生。加入35ml含0.05（mlm1）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱。然后可用一支l0ml无菌球形毛细吸管，其管口用无菌棉花或纱布包扎且能过滤菌丝的装置，吸出孢子悬液至无菌试管内，将孢子悬液稀释至每毫升含50l00cfu。9.5.3 做试验菌的回收率试验时，加入菌量50l00cfu为宜。加菌量过多，如薄膜法，菌落拥挤，则不好计数；加菌量过少，则误差较大。9.5.4 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1:103。若采用允许的最高稀释级供试液进行验证试验还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么应选择回收情况最接近要求的方法进行供试品的检测。如某种产品对某试验菌有较强的抑菌性能，采用薄膜过滤法的回收率为40，而采用培养基稀释法的回收率为30，那么应选择薄膜过滤法进行该供试品的检测。在此情况下，生产单位或研制单位应根据原辅料的微生物质量、生产工艺及产品特性进行产品的风险评估，以保证检验方法的可靠性，从而保证产品质量。10 检查法10.1 平皿法10.1.1 在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释级供试液各1ml至每个直径90mm的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各1ml至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注23个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。10.1.2 阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。10.1.3 倾注培养基将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）和YPD琼脂培养基（酵母菌）熔化，冷至约45时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，盖上陶瓦盖，或半盖盖，除去冷凝水后，再移去陶瓦盖后，盖上平皿盖置操作平台上待凝。在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。10.1.4 培养细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于2328培养箱中培养5天，必要时延长至7天。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。10.1.5 菌落计数10.1.5.1 一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之间，以及菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。10.1.5.2 供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。10.1.5.3 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多的有形物，且难与菌落相区别。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（12个平皿）。注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中。在计数菌落时作为对照。或用含TTC营养琼脂注皿，经培养后该培养基生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计细菌菌落和区分其他有形物。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用含TTC营养琼脂注皿。TTC的用量应以不抑制微生物生长为宜，通常使用的浓度为0.001。10.1.5.4 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界线，一条链、片作为一个菌落计，但若链、片上出现性状与链、片状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，一般不宜作为计数用。10.1.5.5 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌需在24h，霉菌需在48h做初步点计（点计霉菌菌落时，轻轻翻转平板，勿反复翻转，否则使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。10.1.5.6 在培养3天点计细菌，培养5天点计霉菌时，如菌落极小，不易辨认，细菌计数可延长培养时间至5天；霉菌及酵母菌计数可延长培养时间至7天，再点计菌落数。10.1.5.7 对有异议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。10.1.5.8 含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数，YPD琼脂培养基点计酵母菌数。两者合并计数。10.1.5.9 在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数多的培养基中的菌数为计数结果。10.1.6 菌数报告规则10.1.6.1 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu、霉菌菌落数平均数小于100cfu的平板计数作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。10.1.6.2 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数；当有2个或2个以上稀释剂的菌落数符合上述规定，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数值的值报告。10.1.6.3 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均茵落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数。菌数报告规则示例见下表2。表2 菌数报告规则示例菌数报告规则示例各稀释级（供试液1ml皿）平均菌落计数（cfu）菌数报告数（cfug，ml，10cm2）原液1:10（1）1:102（2）1:103（3）16482640242064864003不可计4206464000400.501005001006000107000110.2 薄膜过滤法10.2.1 薄膜过滤法主要起到富集微生物、分离去除样品中对微生物生长产生干扰的因素的作用，可以有效提高检查结果的灵敏度和可靠性，是近年来微生物检查领域中日益广泛应用的一种技术手段。10.2.2 薄膜过滤法采用的滤膜孔径应不大于0.45um。滤膜直径一般为50mm，为便于计数，以及减轻供试液堵塞滤膜的情况，在便于操作的前提下，可以选用直径更大的滤膜或薄膜过滤器。采用不同直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。10.2.3 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，以滤膜直径为50mm的滤膜计，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml；其他直径的滤膜及薄膜过滤器可按膜面积比例调整，总的原则是避免大体积、过高流速的冲洗造成滤膜上的微生物受损伤。10.2.4 由于供试液中一些不能通过滤膜的颗粒存在，常常造成滤膜堵塞、压力升高，严重情况时可能发生过滤装置炸裂造成安全事故或实验室污染；也可能发生由于压力过大滤膜开裂或滤膜孔径变大，造成滤膜对微生物的过滤截留失败。所以，实际操作中应考虑对薄膜过滤中的压力控制和设备的安全性，设置一定的安全压力限度，例如滤膜两侧压差不得过50psi。具体压力限度应根据具体薄膜过滤装置及滤膜确定。10.2.5 采用适当方法去除供试液中的颗粒（前提是不能影响微生物的回收率）、适当增加薄膜面积或降低过滤液体流速可以有效降低滤膜两侧的压力差。10.2.6 取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量见10.2.3及10.2.4。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。10.2.7 贴膏剂宜采用薄膜过滤法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。10.2.8 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。10.2.9 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。10.2.10 菌数报告规则 以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品），或1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。10.3 培养基稀释法取低稀释级供试液（原液或1:10供试液或其他供试液）2份，每份各1ml，分别注入平皿中（每皿0.5ml、0.2ml或0.2m1），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每份供试液所加注平板点计的菌落之和，即为每lml菌落数，共得2组数据。以2份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。10.4 结果报告10.4.1 菌落数在100以内时，按实有数据报告。10.4.2 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。10.5 复试供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应从同一批样品中随机重新取2倍包装量的供试品，依法作单项复试两次，以三次检验结果的均值报告。若3次结果的平均值超过该品种项下的规定，判供试品不符合规定；否则，判供试品符合规定。10.6 注意事项10.6.1 菌落计数测定每计数单位（每皿或每膜）的最适计数范围不宜过低，通常每计数单位不应少于25cfu，低于这一限度越多误差越大，故应根据实际微生物限度标准和污染程度确定适宜的供试液稀释级数和计数测定方法。当标准限度过低或因为操作需要供试品稀释程度过高，可以取较大体积供试液通过薄膜过滤法富集计数测定。不同限度标准宜采用的供试液稀释级及对应宜采用的计数测定方法见下表3。表3 不同限度标准宜采用的供试液稀释级及对应宜采用的计数测定方法限度标准cfug，ml，10cm2一般23个供试液稀释级对应宜选用的计数测定方法原液1:10（1）1:102（2）1:103（3）1:104（4）1010100100010000：平皿法（供试液体积：1ml皿）；：平皿法（培养基稀释法供试液体积：1ml皿）；：薄膜过滤法（供试液体积可以比较灵活）。10.6.2 供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。10.6.3 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1h。否则，可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果。10.6.4 供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液，以免造成实验误差。10.6.5 为避免细菌菌落蔓延生长，宜采取下列方法处理：10.6.5.1 开盖干燥 将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机12h后合盖，放入培养箱培养。10.6.5.2 换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。10.6.5.3 加TTC 于倾注培养基前，在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1TTC溶液1ml（最终浓度为0.001），混匀后倾注平皿。11 检验报告书写本品按中国药典2010年版微生物限度检查法标准检验，结果符合或不符合规定。表4 细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较（营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板）菌落形态细菌霉菌酵母菌菌落大小差别很大，在同一平板上可出现针尖大小至大于10mm菌落一般较大，亦有细小的菌落。在同一平板上生长的菌落大小有时不一致多数直径为12mm，在同一平板上生长的菌落大小有时不一致外观形态多样，小而突起或大而扁平多为圆形，有的蔓延生长为无定形培养基表面生长者多为圆形，内层生长者为圆形、铁饼、纺锤或三角形色泽白、灰白或无色，亦有淡褐、淡黄及淡红色，菌落正反面颜色相同小菌落灰白，大菌落形成孢子后颜色多样。菌落正反面颜色不同乳白或粉红色多见，在同一平板上色调较单一透明度透明或不透明小菌落半透明有明显折光性，大菌落不透明透明较差边缘整齐或不整齐。有放射线状、树枝状、锯齿状、卷发状。低倍镜下一般见不到边缘菌丝体构成，多呈放射状整齐、低倍下可见球状卵圆状或假菌丝状细胞细密排列气味一般有臭味往往有霉味多带酒香味与培养基结合不结合结合较牢固，不易挑起不结合，易挑起生长速度一般很快较慢较快细胞形态球或杆状，细小均一。高倍镜或油镜下可观察形态菌丝体相互交织成熟霉菌常有产孢组织及孢子多数为圆或卵圆形，常有芽体相连排列单个、分散或有一定的排列方式丝状交织单个分散二、控制菌检查l 简述控制菌检查是用于检查某些特定微生物（控制菌或其他致病菌），规定按一次检出结果为准，不再复试。由于控制菌检查为一次性报告实验结果，故应注意方法的有效性确证（方法验证或阳性对照）、实验过程保障和结果确证，以提高检验结果的可靠性。既要避免漏检造成的假阴性结果。也要避免实验室污染造成的假阳性结果。控制菌检查中，涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等，应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外，阳性菌实验室应符合国家级生物安全标准，阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。2 方法验证在建立供试品的控制菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时，应对供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。验证时按各供试品微生物限度项下的规定（给药途径）选择相应的菌株，并按供试液的制备和控制菌检查法所规定的方法进行。2.1 仪器、设备及用具见各控制菌检查项下。2.2 试液、指示液见各控制菌检查项下。2.3 培养基见各控制菌检查项下。2.4 方法验证用标准菌株应根据具体品种项下的目标控制菌选择相应的验证用标准菌株，常用目标控制菌的标准菌株如下：大肠埃希菌Escherichia coli CMCC(B) 44102金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B) 26003乙型副伤寒沙门菌Salmonella paratyphi B CMCC(B) 50094铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104生孢梭菌Clostridium sporogenes CMCC(B)64941白色念珠菌Candida albicans CMCC(F) 98001菌液制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许，接种至l0ml营养肉汤培养基内，置3035培养1824h，取均匀培养物1ml，用0.9无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含菌10100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。生孢梭菌接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，置3035培养1824h，用0.9无菌氯化钠溶液制成1ml含10100cfu的菌液。2.5 供试液的制备（见细菌、霉菌及酵母菌计数）2.6 验证方法2.6.1 试验组取规定量供试液和10100cfu试验菌加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接至增菌培养基中。2.6.2 阳性对照 取10100cfu试验菌加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查法进行检查。2.6.3 阴性对照取相应的稀释液替代供试液，按相应控制菌的检查法进行检查。2.7 结果判定阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。（一）大肠埃希菌1 简述大肠埃希菌（Escherichia coli）即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌。表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保汪人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。用4-甲基伞形酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-D-glucuronide，MUG）和靛基质（indole）试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。实验证明96的大肠埃希菌含-葡糖苷酸酶（-glucuronidase，GUD)，约10的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6，鉴于98的大肠埃希菌基靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，专属性不强。2 仪器、设备及用具（参照细菌、霉菌及酵母菌计数）3 试液指示液3.1 0.9无菌氯化钠溶液（附件二3.1）3.2 无菌磷酸盐缓冲溶液（pH7.2）（附件二3.3)3.3 无菌对氨基苯甲酸溶液（附件二2.2）3.4 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液（附件二3.2）3.5 靛基质试液（附件二2.17）3.6 甲基红试液（附件二4.2）3.7 V-P试液（附件二2.11，2.13）3.8 革兰染色液（附件二2.4，2.10，2.16）3.9 中性红指示液（附件二4.1）3.10 亚甲蓝指示液（附件二4.3）3.11 溴麝香草酚蓝指示液（附件二4.6）3.12 酸性品红指示液（附件二4.7）3.13 曙红钠指示液（附件二4.9）4 培养基4.1 营养肉汤（附件二5.1）4.2 营养琼脂（附件二5.2）4.3 胆盐乳糖（BL）培养基（附件二5.6）4.4 4甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基（附件二5.7）4.5 乳糖发酵培养基、乳糖胆盐发酵培养基、5乳糖培养基（附件二5.21，5.22）4.6 蛋白胨水培养基（附件二5.18）4.7 磷酸盐葡萄糖胨水培养基（附件二5.19）4.8 枸橼酸盐培养基（附件二5.20）4.9 曙红亚甲蓝（EMB）琼脂（附件二5.8）4.10 麦康凯琼脂（附件二5.9）5 准备5.1 对照用菌液（见方法验证）5.2 供试品的检验量（见细菌、霉菌及酵母菌计数5.3）5.3 供试液的制备（见细菌、霉菌及酵母菌计数）6 操作步骤6.1 检验程序阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验 取稀释剂10m1加入100ml（或200 m1）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。6.2 增菌培养 取胆盐乳糖（BL）培养基3瓶，每瓶各100ml。2瓶分别加入规定量的供试液（相当于供试品1g、lml、10cm2），其中1瓶加入对照菌10100个作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养1824h，必要时可延至48h。阴性对照应无菌生长。取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5、24h在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。6.3 分离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上。培养1824h