细胞生物学研究方法-

细胞增殖调控,细胞学相关研究方法细胞增殖细胞周期细胞增殖调控周期运转调控-细胞周期调控系统信号转导调控细胞死亡调控肿瘤的发生细胞增殖和死亡失调,课程内容,细胞的基本结构与功能,Microfilament,MovementTransportCellmorphologyCellcontraction,Microtubule,Transport;Cellmorphology;MitosisandmeiosisCellapparatuslocation,DynamicAbstractiveLogical,细胞生物学研究方法,MethodsandTechniques,内容提要,科研选题实验操作技术细胞生物学方法生物化学方法分子生物学方法免疫学方法,Preparatoryobserve,Putforwardtheoretics,Designcontroltests,Collectdata,Explainresults,Deviseconclusion,Refertoknowledge,科研选题-现实/理论,有意义创新性可行性,Patent/Paper,科学问题（1）心、脑血管疾病（2）癌症（3）糖尿病,12,Diabetes,肥胖高血脂冠状动脉堵塞心肌细胞不可再生,心肌梗塞的发生,选题举例1-临床,左心室重构心力衰竭,心肌梗死主动脉瓣狭窄三尖瓣关闭不全,左心室重构左心室心肌肥大,心肌肥大向衰竭转化心肌层纤维化,心室收缩功能障碍心室舒张功能障碍,心力衰竭,Pluripotentdifferentiationpotentialofstemcells,Adultstemcells,干细胞移植治疗心肌梗死,选题举例2肿瘤细胞的转移,Organselective?,Anoikis：apoptosisresultingfromlossofcell-matrixinteractions,Breastcancer,肠癌的肝转移,细胞生物学技术,一.细胞培养技术：最基本的实验技术原核生物细胞，如细菌（食品、环境污染）；真核单细胞生物，如酵母、四膜虫；植物细胞培养：愈伤组织、原生质体、单倍体培养动物细胞培养病毒的培养动物细胞培养类型：原代培养传代培养,Cardiomyocytes,EScells,实验室常用细胞系,二.细胞形态学观察,光学显微镜正置显微镜倒置-相差显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜活细胞工作站电子显微镜透射电子显微镜扫面电子显微镜扫描隧道显微镜,1.正置显微镜,原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像,（一）光学显微镜,Preparationofspecimen,取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察,GrossandmicroscopicviewsofatumorinvadingnormallivertissueGrossmorphologyofmetastaticlungtumorinliverThelightmicrographofasectionofthetumor,ImmunohistochemicalstudieshaverevealedthatcoloncarcinomasharbouringAPCmutationsdonotcontainnuclear-cateninhomogeneously,异质性,用途：观察活细胞和活组织基本原理把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见,2.倒置-相差显微镜,PhotomicrographsofDbl-transfectedNIH3T3cells(bottompanels)andcontrolNIH3T3cells(toppanels)culturedin10%calfserumandtreatedwitheitherdimethylsulfoxide(DMSO)(vehiclecontrol)or10mM968.,利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，与相差显微镜相比，分辨率更高，图像立体感更强。适合显微操作，常应用于基因注入、核移植、转基因动物等生物工程显微操作,3.微分干涉显微镜,4.荧光显微镜,原理应用,PKH67-labelledmicrovesiclesinternalizedintoendosome-likestructures,mRNAinthemicrovesicles,mRNAincorporatedintothetumormicrovesiclescanbedeliveredintorecipientnormalcellsandgenerateafunctionalprotein.,5.激光共聚焦扫描显微境,用激光作光源，聚光镜和物镜同时聚焦在样品的某一位点上，只有聚光镜聚焦在样品的某一位点上所产生的激发荧光才能清晰成像相当于在荧光显微镜上安装了一套激光共聚焦成像系统能改变焦点获得样品不同切面上的图像，叠加后便可重构样品的三维结构分辨力是普通光学显微镜的3倍，比荧光显微镜分辨率高1.41.7倍,Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM,6.活细胞工作站,Vedio,7.超分辨率显微镜-2014Nobel,（二）电子显微镜,1.透射电子显微镜Transmissionelectronmicroscopy,透射电镜的构造,2.扫描电镜技术,原理：用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大显示出与电子束同步的扫描图像,Scanningelectronmicroscope（SEM）,Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.,GlioblastomacellsproducemicrovesiclescontainingRNA,Cilium,三、流式细胞仪,包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴；激光束的照射下，细胞发出散射光和荧光经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%,应用：检测、分选,Cellsorting,分子生物学方法,PCR分子克隆转基因技术基因敲除（knock-out）基因敲低（knock-down）原位杂交酵母双杂交技术,Realtime-PCR,普通-PCR,Inducedpluripotentstemcell-2012诺奖,A,TheDNA-BD/proteinX(bait)hybridbindstotheGAL1UASbutcannotactivatetranscriptionwithouttheactivationdomain(AD).,YeastTwo-Hybrid,Intheabsenceofbaitprotein,theAD/libraryfusionproteincannotbindtotheGAL4UASandthusdoesnotactivatetranscription.,B,InteractionbetweenthebaitandlibraryproteinsinvivoaactivatestranscriptionofThereportergene.,C,构建诱饵蛋白质粒(BD质粒)检查BD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续)文库质粒(AD质粒)转化带有BD质粒的酵母菌，铺SD/四缺平板挑his+、ade+双阳性克隆作-galactosidase分析，消除假阳性-gal分析阳性质粒在SD/四缺平板与摇管中传代，去除无效AD质粒传代阳性酵母质粒分离，转化大肠杆菌，获得大量阳性AD质粒检查AD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续)AD质粒转化带有BD质粒的酵母菌，再次验证其相互作用阳性AD质粒测序，按在酵母中读框方式进行蛋白同源性查询如果找到候选蛋白，克隆其如果找不到候选蛋白，有可能全基因，采用GST融合表达是新基因，可进一步分析，设技术和体外翻译技术在蛋白计引物，克隆全基因并进一步验证基因在真核细胞中的表达及定位分析双杂交系统文库筛选过程流程图,免疫学方法,单克隆抗体技术免疫化学染色Westernblot免疫共沉淀染色质免疫共沉淀,单克隆抗体技术,B淋巴细胞在抗原的刺激下分化成浆细胞产生抗体，每一个B细胞只能接受单一抗原刺激产生特异性抗体，即单克隆抗体。但B淋巴细胞不易在体外存活。瘤细胞可以在体外培养生存并无限增殖，但不分泌特异抗体；骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的B淋巴细胞融合，融合细胞既具有肿瘤细胞无限增殖的特性又具有B淋巴细胞分泌特异抗体的能力，融合细胞称为杂交瘤细胞。,免疫细胞化学染色,根据抗原与抗体