细胞生物学未打印--2--细胞凋亡与细胞衰老

华中农业大学动物传染病教研室周红波E-mail：hbzhou,细胞死亡与细胞衰老CellDeathandCellAging,细胞的复制能力是有限的？,一、细胞衰老,AlexisCarrel（1873-1944）创伤修复、器官移植领域，1912年诺贝尔奖得主,鸡心脏成纤维细胞,持续分裂了34年,寿命：3-5年，世界纪录14年,体外培养的细胞是永生的！？,1881，AugustWeismann细胞的复制能力是有限的。,一、细胞衰老,鸡心脏成纤维细胞,持续分裂了34年,寿命：3-5年，世界纪录14年,体外培养的细胞是永生的！？,leonardhayflick老年医学的先驱,体外培养的细胞是永生的！？,分裂40次的雄性成纤维细胞,分裂10次的雌性成纤维细胞,细胞的分裂是由细胞自身所决定的！,细胞复制型衰老，体外培养细胞经过有限次分裂之后，停滞分裂，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。,一、细胞衰老,AlexisCarrel（1873-1944）创伤修复、器官移植领域，1912年诺贝尔奖得主,鸡心脏成纤维细胞,持续分裂了34年,寿命：3-5年，世界纪录14年,体外培养的细胞是永生的！？,细胞复制型衰老，体外培养细胞经过有限次分裂之后，停滞分裂，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。,Hayflick极限,体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick极限”。正常细胞具有有限分裂次数癌细胞（HeLa细胞）能在体外无限增殖传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。,体外培养细胞寿命与机体寿命成正比。细胞的增殖能力与供体年龄有关。,成年小鼠各类细胞的寿命,接近或等于自身寿命的细胞,神经元、肾髓质、肌细胞,脂肪、胃酶原细胞,骨、肾上腺髓质细胞,缓慢更新的细胞(长于30天),呼吸道上皮、肾上腺皮质细胞,肾皮质、皮肤结缔组织、肝细胞,胰脏腺泡及胰岛、唾液腺细胞,快速更新的细胞(少于30天),皮肤表皮、角膜上皮细胞,口腔和胃肠道上皮细胞,红细胞、白细胞,细胞总体的衰老可以反映机体的衰老，而机体的衰老是以总体细胞的衰老为基础的。根据细胞衰老速度不同将其分为三类：,二、细胞衰老的机制,损伤-应答理论损伤的累积和对损伤的应答这两方面共同决定细胞的衰老和寿命。应答能力的强弱由物种的特定基因决定。,氧自由基导致DNA损伤、脂类过氧化、蛋白质变性，特别是对DNA的损伤超过一定限度后，细胞就走向死亡。,转超氧化物歧化酶基因的果蝇寿命延长了34%-40%。,代谢产物中引发细胞损伤的主要是氧自由基。,细胞内存在一套抗氧化酶及抗氧化小分子，如超氧化物歧化酶（SOD），谷胱苷肽等能够清除代谢过程中产生的氧自由基，以降低其导致的损伤作用。,2.复制衰老（端粒与细胞衰老）,细胞分裂,端粒阈值,端粒是位于染色体两端的重复DNA序列，细胞分裂时，部分端粒丢失，被细胞感知为DNA损伤。端粒的长度决定细胞的寿命，端粒的缩短导致细胞的衰老和死亡。端粒酶可补充丢失的端粒。,端粒酶（Telomerase）,端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于反转录酶。它以自身的RNA作为端粒DNA复制的模板，合成出DNA序列后添加到染色体的末端并与端粒蛋白质结合，从而稳定了染色体的结构。在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂复制的细胞之中，才可以侦测到具有活性的端粒酶。端粒酶的存在，就是把DNA复制机制的缺陷填补起来，即由把端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂复制的次数增加。由于端粒酶在正常体细胞中几乎不表达而在肿瘤细胞中表达量较大，故将其作为肿瘤治疗的靶点，直接抑制其活性或是从基因层面进行操作，来抑制癌细胞分化，治疗癌症。,2009年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家伊丽莎白布莱克本、卡萝尔格雷德和杰克绍斯塔克，以表彰他们“发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的”。,染色体端粒缩短与细胞衰老端粒端粒钟学说（telomereclocktheory)端粒（telomere)是染色体末端特殊结构。人类端粒（TTAGGG)nn=250-1500端粒长度取决于端粒酶的活性。,stop,端粒长度,美国德克萨斯大学西南医学中心的细胞生物学及神经系统科学教授杰里.谢伊和伍德林.赖特做了这样一项试验：在采集的包皮细胞（包皮环切术的附带产物）中导入可产生端粒酶的基因。一般来说，包皮细胞在变老之前可分裂60次左右。但导入端粒酶后，细胞已分裂了300多次却毫无终止的征兆，也没有显示任何异常的迹象。“细胞在端粒酶的作用下，就像被注入了兴奋剂的小兔子，”谢伊说，“它们只管没完没了地分裂繁殖。”与此同时，谢伊和赖特的合作伙伴美国杰龙（Geron）公司的研究人员，采用人体视网膜细胞做了相同的试验。结果，这些细胞似乎也变得长生不老了。,实际上，这种酶也有令人忧虑之处：人们发现它也存在于85%的肿瘤之中，可能是造成癌细胞无节制增生的元凶。尽管如此，只要研究人员充分认识其作用原理，就完全可能开发出既可防止衰老，又能制服癌症的新技术。,端粒酶使细胞“长生不老”,绵羊多利（Dolly，1996年7月5日-2003年2月14日）是用细胞核移植技术将哺乳动物的成年体细胞培育出新个体。是第一个被成功的克隆哺乳动物。,只活了不到7年，而绵羊的正常寿命应该是12年左右，多利的端粒被发现比较短。,端粒与早衰,2.细胞衰老的变化特征,（1）形态变化：总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化。,、核膜内折,（2）分子水平的变化DNA：从总体上DNA复制与转录在细胞衰老时均受抑制，但也有个别基因会异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失。RNA：mRNA和tRNA含量降低。蛋白质：含成下降，蛋白质稳定性、抗原性，可消化性下降，自由基使蛋白质肽断裂，交联而变性。酶分子：活性中心被氧化，金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失，酶分子的二级结构，溶解度，等电点发生改变，总的效应是酶活性改变。脂类：不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。,（3）衰老细胞检测的生物学特征,不可逆的生长停滞，停止分裂。-半乳糖苷酶在pH6即可活化（pH4-pH6）。,-半乳糖苷酶在pH6条件下进行底物染色,衰老细胞细胞通常体积变大，表达有高酶活性的-半乳糖苷酶。,二、细胞死亡,Apoptosis凋亡,Necrosis坏死,Autophagy自噬,（一）细胞凋亡,Apo-ptosis来源于希腊语，fromfall;细胞的死亡犹如秋天树叶的凋落。受基因调控的自主的生理性细胞自杀行为，亦称程序性死亡(programmedcelldeath,PCD),SydneyBrenner1/3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstituteBerkeley,CA,USAb.1927(inUnionofSouthAfrica),H.RobertHorvit1/3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)Cambridge,MA,USAb.1947,JohnE.SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstituteCambridge,UnitedKingdomb.1942,THE2002NOBELPRIZEWINNER,1.细胞凋亡的形态特征及过程,细胞体积缩小、核内染色质固缩、细胞质凝聚、细胞裂解，进而细胞膜内陷将细胞自行分割为单位膜包围的小体而形成凋亡小体。死亡的细胞由吞噬细胞清除而不诱导炎症反应。,胸腺细胞,细胞凋亡的过程,1、凋亡的起始，细胞间接触消失，但质膜完整；染色质固缩、形成星月形帽状结构沿核膜分布。2、凋亡小体的形成，核染色质断裂成大小不等的片段与某些细胞器一起聚集，产生许多芽状的凋亡小体。3、凋亡小体被临近的细胞吞噬。,细胞凋亡的整个过程中，细胞质膜始终保持完整，无泄露，因此不诱导炎症反应。,正常细胞,细胞凋亡开始,染色质固缩，沿核膜分布，细胞质亦固缩,细胞膜反折，凋亡小体形成,染色体形成串状片段，细胞器膨胀，线粒体基质呈絮状。,细胞膜破裂，细胞解体，机体炎症反应。,细胞坏死开始,（1）确保正常发育生长：清除多余的细胞，免疫耐受的形成等生理病理过程具有重要意义。（凡是不能区分“自我”与“异我”抗原的淋巴细胞均发生凋亡）,2.细胞凋亡的生物学意义,（1）确保正常发育生长：清除多余的细胞，免疫耐受的形成等生理病理过程具有重要意义。,2.细胞凋亡的生物学意义,（2）维持内环境稳定：清除体内多余、受损、突变、衰老的细胞,2.细胞凋亡的生物学意义,2.细胞凋亡的生物学意义,病毒感染细胞在Tc、M的诱导下凋亡。,（3）积极防御功能：对病毒感染细胞阻止,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，AIDS病毒感染,3.细胞凋亡的检测方法,(1)形态学观察,A.正常T细胞杂交瘤细胞（扫描电镜）B.凋亡T细胞杂交瘤细胞C.膜出泡处理的凋亡细胞（透射电镜）,(2)DNA电泳检测,180-200bp或其整数倍的DNA片段梯状条带（DNALadders）,(3)TUNEL(terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)-mediateddUTPnickendlabeling)，DNA断裂的原位末端标记法,在细胞凋亡过程中，基因组DNA会断裂产生3-OH末端加入末端脱氧核苷酸转移酶和标记的dUTP，标记的dUTP会被加入到3-OH末端。标记的dUTP可通过颜色、荧光等反应出凋亡特性。,流感病毒感染晚期所致的细胞凋亡,（4）流式细胞分析,根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙锭（PI）使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期的状态。,4.细胞凋亡的分子机制,诱导细胞凋亡的因子：物理因子：射线（紫外线，r射线），温度刺激（热激，冷激）化学及生物因子：活性氧基团（超氧自由基，羟自由基），正常生理因子（激素，细胞生长因子）的失调以及凋亡因子处理（肿瘤坏死因子a）等。,两种凋亡方式：Caspase（天冬氨酸特异性的半胱氨酸水解酶）依赖性的细胞凋亡不依赖于Caspase的细胞凋亡,4.细胞凋亡的分子机制,凋亡起始者（细胞凋亡的激活期）：对执行者前提进行切割，产生有活性的执行者。包括casepase-2，-8，-9，-10，-11,凋亡执行者（细胞凋亡的执行期）：负责活化一系列的蛋白酶和核酸酶，切割细胞的结构蛋白和调节蛋白，导致细胞凋亡。包括casepase-3，-6，-7,caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白蛋白天冬氨酸残基后的肽键。Caspase1-15.,4.细胞凋亡的分子机制（依赖于Caspase的细胞凋亡）,凋亡信号,凋亡起始者活化,凋亡执行者活化,激活一系列的蛋白酶和核酸酶,凋亡起始者活化,外源途径,4.细胞凋亡的分子机制,凋亡信号,凋亡执行者活化,激活一系列的蛋白酶和核酸酶,凋亡起始者活化,内源途径,4.细胞凋亡的分子机制,凋亡信号,凋亡信号,凋亡起始者活化,凋亡执行者活化,激活一系列的蛋白酶和核酸酶,凋亡起始者活化,凋亡信号,凋亡起始者活化,凋亡执行者活化,凋亡,内源途径,外源途径,4.细胞凋亡的分子机制,Casepase，天冬氨酸特异性的半胱氨酸水解酶。,外源途径,死亡诱导信号复合物（DISC）,内源途径,细胞内部信号（DNA损伤）可导致线粒体外膜通透性改变，细胞色素C释放，与凋亡因子Apaf-1结合后，激活caspase-9，并通过级联反应激活casepase-3，从而引起凋亡。,病毒感染细胞的凋亡,4.细胞凋亡的调控,Casepase抑制因子：IAP（inhibitorofapoptosis）,P53，重要的肿瘤抑制基因和促凋亡因子。,P53可以抑制抗凋亡因子Bcl-2的表达,激活凋亡正调节因子的表达来促进凋亡,天花病毒CrmA(cytokineresponsemodifier)就是典型的casepase抑制剂，抑制了感染细胞的凋亡，从而有利于病毒增殖。非洲猪瘟（ASFV）LMW5-h1基因与原癌基因bcl-2和EBV的bhrf1基因有同源性，通过抑制受感染细胞的Apoptosis，而使病毒持续性复制，感染细胞得以长期存活。流感病毒的NS1蛋白在感染早期其诱导凋亡的功能域被掩盖，从而抑制受感染细胞的Apoptosis，使病毒持续性复制。但在感染后期，其凋亡结构域暴露出来，又诱导感染细胞的Apoptosis，从而促进病毒粒子的释放。,5.病毒调控细胞凋亡,Casepase作为肿瘤药物,凋亡药物,（二）细胞坏死,由严重损伤引起，以细胞快速肿胀和溶解为特征，胞浆出现空泡，细胞膜破损、细胞内容物（膨大和破裂的细胞器以及染色质片段）流出，引起周围组织炎症反应。,1.坏死细胞的早期阶段，染色质形成串状片段，细胞器膨胀。2.坏死的后期，胞膜破裂，内容物散逸。,病原感染,宿主细胞,凋亡,坏死,（二）细胞自噬,当细胞在缺乏营养或发生应激反应时，可发生细胞自噬现象。指细胞内的溶酶体降解自身细胞器和其他大分子的过程。细胞开始自噬时，细胞质中形成大量由双层膜包裹着的待降解物质的泡状结构，称自噬泡。随后，自噬泡与溶酶体发生融合，自噬泡所包裹着的待降解物质进入溶酶体，此时的溶酶体称作自噬溶酶体。在自噬溶酶体中，待降解物质在各种酶的作用下分解成氨基酸和核苷酸等，并进入三羧酸循环，产生小分子和能量（ATP），再被细胞所利用。,细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。,在机体受到脊髓灰质炎病毒和SARS冠状病毒等病原体感染时，细胞自噬具有双重作用。一方面，细胞自噬能将进入胞内的病原体，通过降解作用加以清除，保护正常细胞不被感染；另一方面，细胞自噬形成的自噬泡双层膜结构成为病毒或细菌的“避难所”，使其逃避宿主的清除作用。,细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程。细胞自噬的异常导致癌细胞的出现。,机体结构,细胞增殖,细胞分化,细胞凋亡,细胞信号转导,染色体,（DN