第3章细胞生物学研究方法翟中和第四版

第二章小结,细胞是一切生命活动的基本单位（涵义）细胞的基本共性细胞膜，两种核酸（DNA与RNA），蛋白质合成机器核糖体与一分为二的增殖方式细胞分为原核细胞、古核细胞与真核细胞三大类支原体是迄今发现的最小最简单的细胞细菌与蓝藻是原核细胞的两个重要代表真核细胞的三大结构体系病毒是非细胞形态的生命体,第3章细胞生物学研究方法,生物学研究模式生物,Caenorhabditiselegans,Drosophilamelanogaster,Arabidopsisthaliana,生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制,研究技术、研究工具,显微镜的出现细胞学说的建立电子显微镜技术进入超微与分子形态水平超离心技术细胞成分、代谢过程的同位素示踪技术精确定性、定量分析单克隆抗体、分子杂交生物工程,本章主要内容,细胞形态结构的观察方法细胞及其组分的分析方法细胞培养与细胞工程细胞及其生物大分子的动态变化模式生物与功能基因组的研究,病毒20-200nm支原体0.1-0.3m细菌0.5-5.0m动植物细胞20-30m活细胞多是无色透明的,直径,第一节细胞形态结构的观察方法,显微镜观察范围肉眼观察范围,人眼的分辨率0.2mm，光学显微镜的分辨率0.2m，而电子显微镜可达0.2nm。,肉眼0.2mm光学显微镜0.2m电子显微镜0.2nm扫描隧道显微镜样品制备技术,分辨率,一、光学显微镜(lightmicroscope),从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具,1.目镜2.准焦螺旋3.物镜4.载物台5.反光镜,（一）普通复式光学显微镜组成,由3部分组成：光学放大系统（目镜与物镜）照明系统（光源和聚光镜）镜架及调节系统,（一）普通复式光学显微镜成像,放大的倒立虚像经物镜形成倒立实像经目镜进一步放大成虚像,（一）普通复式光学显微镜分辨率,对任何显微镜来说，重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率0.2m,:光源波长N:介质折射率,空气为1,油为1.4:物镜镜口角(样品对物镜镜口的张角,最大140o,Sin/2最大0.94),甲醛,石蜡,5m,（一）普通复式光学显微镜样品制备,发明：19341935荷兰物理学家Zernike设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。,优点：样品不需染色，可以观察活细胞。,原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,相差显微镜,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察A.当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加，亮度增强。B.当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差。这是在构造上，相差显微镜不同于普通光学显微镜两个特殊之处。,体外培养MDCK细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较,微分干涉相差显微镜（DIC）,1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,1、分辨率比普通光镜提高了一个数量级2、录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程,特点：,Fourtypesoflightmicroscopy,(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy（光学显微镜）(B)phase-contrastmicroscopy(相差显微镜)(C)differential-interference-contrastmicroscopy(微分干涉相差显微镜)(D)dark-fieldmicroscopy(暗视野显微镜),正置显微镜与倒置显微镜比较,组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,（三）荧光显微镜实物,（三）荧光显微镜基本原理,荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长),特点：1.利用汞灯或氙灯作为荧光激发光源，波长较短，分辨率高于普通显微镜；2.核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头；3.滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成。应用：对细胞内生物大分子进行定性、定位研究。,物镜,样品,目镜,阻断滤光片,（三）荧光显微镜基本原理,（三）荧光显微镜样品制备,免疫荧光技术荧光素直接标记技术绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位,（三）荧光显微镜应用,在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具,荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结构成分,共聚焦显微镜及其显微图像,（四）激光扫描共焦显微镜,以激光为光源聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像分辨率比普通荧光显微镜1.41.7倍,（四）激光扫描共焦显微镜,可通过“光学切片”叠加后重构出样品的三维结构,3DImageReconstruction,荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）,蓝色为细胞核，绿色为微管,透射电子显微镜transmissionelectronmicroscope,TEM,二、电子显微镜,（一）透射电子显微镜特点,电子束作为光源电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像通过荧光屏或感光胶片记录,*电子显微镜与光学显微镜的基本区别,电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50100千伏时，电子束波长约为0.00530.0037纳米,1电子显微镜与光学显微镜的基本区别,2电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数,电子显微镜分辨率可达0.2nm电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率,3电子显微镜的基本构造,电子束照明系统成像系统真空系统记录系统,（二）透射电镜制样技术超薄切片技术,超薄切片,黑白图像,超薄切片机,超薄切片技术显示的细胞超微结构,应用超薄切片技术，几乎可以观察细胞的各种超微结构,Figure9-45MolecularBiologyoftheCell(GarlandScience2008),用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，凹陷处铺了一薄层重金属盐，而样品凸出的地方则没有染料沉积，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明”地光亮。*负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。,（二）透射电镜制样技术负染色技术,（二）透射电镜制样技术负染色技术,观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染）分辨率可达1.5nm左右,（二）透射电镜制样技术冷冻蚀刻技术,包括冰冻断裂与蚀刻复型两步观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感样品不需固定包埋,冰冻蚀刻电镜照片细胞断裂面结构,透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较,电镜三维重构与低温电镜技术,电镜三维重构技术低温电镜技术电子扫描断层成像技术,核孔复合物,（三）扫描电镜技术,利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌,（三）扫描电镜技术,样品利用CO2临界点干燥法处理样品观察前喷镀一层金膜一般扫描电镜的分辨本领仅为3nm,Figure9-49(part1of2)MolecularBiologyoftheCell(GarlandScience2008),Redbloodcell,Yeast,Sperm,小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较,注意样品制备技术的差异！,三、扫描隧道显微镜,探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中的隧道效应具有原子尺度的高分辨本领可以在真空、大气、液体等多种条件下工作非破坏性测量,/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png,正置显微镜与倒置显微镜比较,第二节细胞及其组分的分析方法,一、用超离心技术分离细胞组分,差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开,差速离心,一、用超离心技术分离细胞组分,密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带,1.速度沉降velocitysedimentation,用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,2.等密度沉降isopycnicsedimentation,用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,用超速离心技术分离细胞组分,差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离,用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物,二、细胞成分的细胞化学显示方法,显色剂与细胞组分中特殊基团的结合通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量,福尔根反应Feulgenstain,特异显示细胞内呈紫红色的DNA的分布原理：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂（Schiffsreagent）反应呈紫红色。,DNAFeulgen反应,多糖PAS反应如淀粉、纤维素及动物细胞中的糖原、粘蛋白等。,脂类苏丹染色等,蛋白质Millon反应,三、特异蛋白抗原的定位与定性,细胞内特异蛋白的显示可通过抗原抗体特异结合的方法得以实现若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察,抗原：能刺激机体产生抗体的物质。,抗体：由抗原刺激在机体内产生，并与抗原发生特异性结合的蛋白质的总称。,多克隆抗体：由不同的B淋巴细胞产生的抗体混合物。,（一）免疫荧光技术,免疫荧光技术：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。利用荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。,（一）免疫荧光技术,（一）免疫荧光技术,直接间接免疫荧光技术（A）间接免疫荧光技术（B）,免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架,将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。,免疫胶体金技术：将抗体与金颗粒偶联，经免疫染色后，在电镜下金颗粒所在部位即为抗原位置。,（二）免疫电镜技术,（二）免疫电镜技术,在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位免疫胶体金技术受到越来越多的青睐,四、细胞内特异核酸的定位与定性,原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置,原位杂交技术,光镜水平同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,五、定量细胞化学分析与细胞分选技术,主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,流式细胞术（FlowCytometry）,排列成单列的细胞通过激光束时，仪器可测定出标记细胞上的荧光强度；仪器使带有荧光细胞的小水滴充电；带电水滴通过高压偏转板偏离原来方向，收集细胞；未含标记的细胞或不含有细胞的水滴不偏转。,五、定量细胞化学分析与细胞分选技术,流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flowcytometer）。,第三节细胞培养与细胞工程,细胞培养技术是细胞生物学研究方法中最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等。,一、细胞培养,体外培养细胞必须注意三个环节：,物质营养、生存环境和废物的排除。,体外培养的动物细胞可分为,原代细胞：是指从机体取出后立即培养的细胞，一般指培养的第2代至传10代以内的细胞。,传代细胞：是指适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。,*,原代细胞培养步骤：胰酶或胶原酶与EDTA，将细胞从体内分离出来，在模拟体内环境的条件下，让其生存和生长。,一、细胞培养动物细胞培养,有限细胞系（cellline）：细胞传至50代以后，又出现危机，不能再传下去，这种传代次数有限的体外培养细胞称为有限细胞系。,仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为,染色体改变，呈亚二倍体或非整倍性，失去接触抑制,永生细胞系：在传代过程中部分细胞发生遗传突变，带有癌细胞的特点，在培养条件下可无限传代，这种传代细胞又叫连续细胞系。,*,肿瘤细胞失去接触抑制行为,细胞克隆：利用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中选择单个细胞，并由此增殖形成具有基本相同遗传性状的细胞群体称为细胞克隆。,*,*,细胞株（cellstrain）：经生物学鉴定，具有特殊的遗传标记或性质的细胞克隆，称为细胞株。,一、细胞培养动物细胞培养,基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞贴壁培养和悬浮培养,Hela,CHO,成纤维细胞,上皮样细胞,目前实验室中常用的几种细胞系,利用植物细胞具有的全能性。单倍体细胞培养原生质体培养,一、细胞培养植物细胞培养,一、细胞培养植物细胞培养,单倍体细胞培养：用花药或花粉在人工培养基上进行培养，通过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株,一、细胞培养植物细胞培养,原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株,二、细胞工程,细胞融合,通过培养和诱导，两个或多个细胞融合为一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交。动物细胞融合一般用灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如PEG）介导；植物细胞融合时，先用纤维素酶去掉纤维素壁。,（一）细胞融合与单克隆抗体技术,（一）细胞融合与单克隆抗体技术,细胞融合灭活的病毒化学物质（如PEG）电融合同核体（homokaryon）异核体（heterokaryon）合核体（synkaryon）,单克隆抗体技术,1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。原理：B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。,单克隆抗体的制备,1.细胞拆合：把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。,物理法：机械法或短波光,细胞拆合分为,化学法：细胞松弛素,（二）显微操作技术与动物的克隆,显微操作仪,显微操作技术：显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等。,正在进行核移植操作,（二）显微操作技术与动物的克隆,克隆羊多莉的培育,第四节细胞及生物大分子的动态变化,MartinDN,BaehreckeEHDevelopment2004;131:275-284,一、荧光漂白恢复技术,亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率,fluorescencephotobleachingrecovery，FPR,Figure10-36aMolecularBiologyoftheCell(GarlandScience2008),二、单分子技术与细胞生命活动的研究,指在单分子水平上对生物分子的行为(构象变化、相互作用、相互识别等）的实时动态检测以及在此基础上的操纵调控等,useopticaltrapstoprobethesteppingofsinglemoleculesofkinesin,Fluorescentimageofsinglemotorproteins(left):Motionoftwodiffusingkinesinmolecules(green)onamicrotubule(red)shownasatimeserieskymograph.Schematic(right):Bydraggingdiffusingkinesinmoleculeswithlasertweezersoveramicrotubule,thefrictionforcebetweenthemotoranditsmicrotubuletrackcanbemeasuredveryprecisely,三、酵母双杂交技术,在体内分析蛋白质蛋白质相互作用利用转录激活因子的DNA结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理,四、荧光共振能量转移技术(FRET),分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态S0(electronicgroundstate)的最低振动能级吸收光能以后，它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级。这过程发生在10-15s时间内被激发的分子，首先释放能量回到S1的最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级，并以光子的形式释放能量，即发射荧光,FRET产生的条件,D、A都能发荧光D的发射光谱和A的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠D和A之间的距离必须小于10nm。,FRET的基本原理,检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光,五、放射自显影技术,利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示,根据实验要求选择合适的同位素,研究DNA合成时通常用氚（3H）标记的3H-TdR研究RNA合成用3H-U在研究含硫蛋白分子代谢时，用35S标记的蛋氨酸和半胱氨酸,对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪：持续标记、脉冲标记显微放射自显影电镜放射自显影,胰岛B细胞电镜放射自显影结果,3H-亮氨酸脉冲标记完成10分钟后，被标记的胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中3H-亮氨酸脉冲标记完成45分钟后，被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内,第五节模式生物与功能基因组的研究,Figure1-44MolecularBiologyoftheCell,FifthEdition(GarlandScience2008),一、细胞生物学研究常用的模式生物,模式生物通常个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物,Whydoweneedmodelsystems?,AllcellsaredescendedfromacommonancestorSimplesystemstostudyabiologicalquestionExtrapolate（外推）resultstohighe