蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本的制备 坐骨神经干标本的制备、缝匠肌神经标本制备

实验六 蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本的制备坐骨神经干标本的制备、缝匠肌神经标本制备一、实验目的1、急性动物实验（与慢性动物实验的区别）2、离体标本实验（与在体标本实验的区别）3、掌握锌铜弓导致生物电产生的原理4、掌握离体标本的制备及手术训练5、掌握剪刀的技用和双毁髓的意义二、实验原理1、急性动物实验与慢性动物实验，在体实验与离体实验急性动物实验可分为离体和在体实验两种方法。离体实验：是从活着的或刚处死的动物身上取出所需要的器官、组织、细胞或细胞中的某些成分。置于一个能保持其正常功能活动的人工环境中，观察某些人为的干预因素对其功能活动的影响。例如，对离体蛙心或动物血管条进行灌流，可用于研究某些生物活性物质或药物对心肌或血管平滑肌收缩力的影响；应用膜片钳技术可研究细胞小片膜上单个离子通道的电流特性。在体实验：是在动物麻醉条件下，手术暴露某些所需研究的部位，观察和记录某些生理功能在人为干预条件下的变化。例如，以动脉插管记录动物血压，可用于观察某些神经或体液因素对血压的影响；将玻璃微电极插入脑内某些部位进行细胞外或细胞内记录，观察神经元在接受某些刺激时放电活动的变化，以了解这些神经元的生理功能。急性动物实验的优点是实验条件比较简单，条件较易控制，便于进行直接的观察和细致的分析；离体实验则更能深入到细胞和分子水平，有助于揭示生命现象中最为本质的基本规律。但急性动物实验的结果可能与生理条件下完整机体的功能活动有所不同，尤其是离体实验的结果，此时被研究的对象，如器官、组织、细胞或细胞中的某些成分已经脱离整体，它们所处的环境已发生很大的改变，实验结果与在整体中的真实情况相比，可能会有很大的差异。慢性动物实验：慢性动物实验以完整、清醒的动物为研究对象，且尽可能保持外界环境接近于自然，以便能在较长时间内观察和记录某些生理功能的改变。实验前一般需对动物作某些预处理，待动物康复后再进行观察。例如，研究唾液的分泌调节时，可预先将唾液腺导管开口移至颊部体表，观察时就能方便地从体表收集到唾液腺分泌的纯净唾液；研究某种内分泌功能时，常先摘除动物某个内分泌腺，以便观察这种内分泌激素缺乏时以及人为替代后的生理功能改变，用以了解这种内分泌激素的生理作用。慢性动物实验适用于观察某一器官或组织在正常情况下的功能以及在整体中的作用地位，但不宜用来分析某一器官或组织细胞生理功能的详细机制。与急性动物实验相比，慢性动物实验的干扰因素较多，实验条件较难控制。2、锌铜弓的作用及原理锌铜弓：在生理学实验中，锌铜弓是检验标本机能活性最常用而简易的刺激器。由铜片和锌片两种金属制成。锌铜弓具有刺激作用，是因为金属与溶液之间产生电位差，即电极电位。通常将金属浸入电解质溶液中，如Zn便溶解而成Zn离子。而在Zn的里面则形成负离子。Cu在溶液中则相反，金属与溶液之间便产生了电位差电极电位。如果将Zn和Cu一端接触，则在接触部位电流由Cu向Zn方向流动；而在溶液中则相反，由Zn向Cu流动。当锌铜弓接触组织时（注意：表面必须湿润），电流便沿Zn可兴奋组织Cu方向流动，而产生流动作用。这样，锌铜弓好像一个电池，Zn如同其阳极，Cu好像阴极而发挥作用。神经或肌肉的电刺激阈值非常小，所以仅用锌铜弓接触，即可构成刺激，以便检验组织的机能活性。3、蟾蜍作为生理学实验模式生物的优点蛙或蟾蜍等两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织生活条件易于掌握，在任氏液的浸润下，神经肌肉标本可较长时间保持生理活性，因此，在生理学实验中常用蛙或蟾蜍坐骨神经腓肠肌离体标本来观察神经肌肉的兴奋性、兴奋过程以及骨骼肌收缩特点等。4、蟾蜍的毁髓及单毁髓和双毁髓及双毁髓的意义蟾蜍破坏脑脊髓：取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净。右手握住蟾蜍，用食指压住头部前端使头前俯，中指、无名指捏住两前腿，无名指以及小指捏住两后腿，左手持针，当触及到两耳中间的凹陷处时，持针手即感觉针尖下陷，此处即是枕骨大孔的位置。左手持针从枕骨大孔向前刺入颅腔，左右搅动捣毁脑组织，然后将刺蛙针退到枕骨大孔，不拔出而是将其尖转向后插入脊柱管中捣毁脊髓，插入椎管时，蟾蜍后肢立即失去紧张性，多数情况出现尿失禁。若脑脊髓破坏完全，可见蟾蜍四肢松弛，呼吸消失。单毁髓：如毁髓针确在颅腔内，实验者可感到针尖触及颅骨。双毁髓：再将毁髓针退至枕骨大孔，针尖转向后方，与脊柱平行刺入椎管，以捣毁脊髓。彻底捣毁脊髓时，可看到动物的后肢突然蹬直，而后瘫软如棉。双毁髓的意义：这个实验主要是探讨神经纤维冲动产生、兴奋传递和肌肉收缩之间的关系，与神经中枢无关。为了制备这个标本需要首先处死青蛙，双毁髓的意义就在于此，这种双毁髓的处死方法，简单易行，关键是相对比较人道。5、蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本的制备（1）剪除上肢和内脏：在骶髂关节上0.51.0cm处用粗剪刀剪断脊柱。用镊子夹住后端脊柱，以剪刀沿脊柱两侧剪除所有内脏及头胸部，留下后肢、骶骨、后端脊柱及紧贴于脊柱两侧的坐骨神经。（2）剥皮：左手用镊子或直接用手捏住脊柱断端（注意不要压迫神经），右手捏住断端边缘皮肤，向下剥去全部后肢皮肤，将标本置于盛有任氏液的培养皿中。（3）分离两腿：用玻璃分针沿脊柱两侧游离出两条坐骨神经，并于近脊柱处各扎一细线，然后在扎线与脊柱之间剪断神经。提着神经上的细线，将两条坐骨神经分别置于两条大腿上，左手持脊柱，将骶骨翘起，将下位脊柱全部剪除。捏着两侧髂骨向反方向分离，使耻骨联合脱臼后，沿耻骨联合正中将两下肢剪开，将一条腿浸于任氏液中备用，另一条置于浸有任氏液的玻璃板上。（2）、（3）两步可变为一手捏住脊柱后端，一手抓着蟾蜍头部向两侧拉开，可直接分离两腿，蟾蜍皮肤仍留在蟾蜍上身部。若试验中当堂进行坐骨神经-腓肠肌兴奋性实验，则不需浸泡入任氏液）（4）游离坐骨神经和剪断股骨：认清坐骨神经沟和腓肠肌的部位，用剪刀剪断梨状肌及其周围的结缔组织，左手提着神经上的细线，右手持剪刀或玻璃分针沿坐骨神经沟细心剥离，直至将坐骨神经剥离到腘窝。将游离干净的坐骨神经放在下腿上，沿膝关节的周围将大腿的所有肌腱剪断，并用剪刀刮净股骨下段附着的肌肉，在股骨上1/3处剪去上段股骨及所附的肌肉，这样制成的称为坐骨神经下腿标本。（6）游离腓肠肌：在坐骨神经下腿标本的基础上，用剪刀将跟腱的下端剪断，在跟腱与肌肉交界处扎一条细线，左手提线，右手用剪刀游离腓肠肌，直到膝关节。做好的标本用锌铜弓的两极轻轻接触坐骨神经，腓肠肌立即收缩，表示标本的兴奋性良好。6、坐骨神经干标本的制备和缝匠肌神经标本制备坐骨神经干标本的制备：蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；标本腹面向上，用玻璃分针分离脊柱两侧神经丛，用线在近脊柱处结扎，剪断神经；将神经干从腹面移向背面。标本背面向上固定，从大腿至跟腱分离坐骨神经。坐骨神经标本置任氏液中备用。缝匠肌神经标本制备：缝匠肌：位于股部腹内侧面，起于耻骨联合，止于胫骨，为一肌纤维平行排列的长条肌肉（图2-4）。缝匠肌受坐骨神经的分支支配。此分支起于梨状肌的尾骨侧下面，沿途又向半膜肌、半腱肌等发出分支。并由内大收肌和股内直肌之间穿过，到达股部腹面。在缝匠肌内侧面下1/3处进入肌肉。由于该神经在走行沿途中一再分支，到达缝匠肌时已很纤细，解剖时需倍加小心以免伤及神经。制备过程：取一侧下肢，腹位置于蛙板上。找到梨状肌，将其在尾骨的附着处剪断。小心分离其下的坐骨神经，认清坐骨神经在此处发出的3个分支。在分支的中枢端结扎坐骨神经，并在结扎线的中枢端以及3个分支的外周端剪断坐骨神经。轻轻提起结扎线，细心地对3个分支略加分离，确认从内直肌和半腱肌之间进入大腿腹面的一支，注意：此分支为支配缝匠肌的神经。再将其它两个分支自坐骨神经起始处剪断，将保留的一支神经置于由任氏液湿润的棉球下以保护之。翻转下肢标本，将其背位置于蛙板上，找到缝匠肌。用尖镊子在其胫骨附着点腱膜下开一小孔，穿线结扎。提起结扎线，用手术剪将结扎线外侧的腱膜剪断。轻轻提起结扎线，用眼科剪沿缝匠肌外侧缘仔细剪开肌膜，直至缝匠肌在耻骨联合的附着处。为保护肌纤维，可在附着处剪下少量耻骨。用玻璃解剖针将缝匠肌以内侧缘为轴翻转180，使其内表面向上，即可清楚地看到支配肌肉的神经在其下1/3的内侧缘进入肌肉。随后将肌肉翻正复原，用眼科剪沿内侧缘由前向后剪开肌膜。注意：留下约2mm神经进入处的肌膜，以便在下一步操作中保护神经不被牵拉。用玻璃解剖针分离内大收肌和股内直肌，将在背面已分离的神经由分离处穿至腹面，在此过程中需将支配其它肌肉的神经分支一一剪断。注意：勿伤及支配缝匠肌的神经，这样即可把坐骨神经-缝匠肌分离出来。用镊子分别夹住耻骨和结扎线。将标本移至盛有任氏液的培养皿内，用锌铜弓检查标本。7、手术剪的分类及剪刀的技用手术剪的分类：根据其结构特点有尖、钝，直、弯，长、短各型。据其用途分为组织剪、线剪及拆线剪。组织剪多为弯剪，锐利而精细用来解剖、剪断或分离剪开组织。通常浅部手术操作用直剪，深部手术操作用弯剪。如图17。线剪多为直剪，用来剪断缝线、敷料、引流物等。如图18。线剪与组织剪的区别在于组织剪的刃锐薄，线剪的刃较钝厚。所以，决不能图方便、贪快，以组织剪代替线剪，以致损坏刀刃，造成浪费。拆线剪是一页钝凹，一页直尖的直剪，用于拆除缝线，如图19。正确持剪刀法为拇指和第四指（无名指）分别插入剪刀柄的两环，中指放在第四指环的剪刀柄上，食指压在轴节处起稳定和向导作用。正确持剪刀法：为拇指和第四指（无名指）分别插入剪刀柄的两环，中指放在第四指环的剪刀柄上，食指压在轴节处起稳定和向导作用。三、实验器材1、 实验动物：蟾蜍1只/组2、 实验设备：低等动物手术器械，锌铜弓，解剖盘等四、实验步骤1、掌握单毁髓和双毁髓的方法及生理意义2、掌握坐骨神经-腓肠肌标本的制备3、缝匠肌神经标本的制备4、坐骨神经干标本的制备5、掌握剪刀的技用和标本的检验6、掌握动物尸体的处理方法和保护方法五、结果与分析1、蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本制作如下图：锌铜弓刺激坐骨神经，则能感到用细线结扎的腓肠肌的肌肉收缩。2、试验中应注意的事项：（1