DNA测序技术简介.ppt

DNA测序技术简介,人类基因组计划（HumanGenomeProjectHGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。,造福人类的HGP：,中国的HGP起步较晚,但中国人口众多,有56个民族和许多遗传隔离群,拥有世界上最丰富的遗传家系资源,对于研究HGP的重要目标之一人类遗传的多样性正具有得天独厚的优势。拥有一批国家重点实验室及专业齐备的科研力量,因此可以根据HGP的目标,结合中国的特点开展研究。1999年7月，我国在国际人类基因组注册，承担了其中1的测序任务，此举标志着我国已掌握生命科学领域中最前沿的大片段基因组测序技术，在结构基因组学中占了一席之地。,我国与HGP：,分析仪器的新发展：,377型遗传分析仪,377型DNA全自动测序仪采用经典的聚丙烯酰胺凝胶的电泳方式,结合美国应用生物系统公司专利的四色荧光标记,激光检测,一个泳道检测的方法,具有测序结果准确性好,精度高,操作简便快速等特点,已成为全球应用最多最广泛的全自动DNA测序仪之一。,310型全自动遗传分析仪,其他DNA全自动分析仪：,ABIPrism3100遗传分析仪,3700型全自动遗传分析仪,安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE500/1000/4000,DNA测序的方法链终止法测序化学降解法测序自动化测序非常规DNA测序,链终止法测序(thechainterminationmethod),ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。这样，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。,生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。,由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。,在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。,方法概述：,脱氧核甘酸与双脱氧核苷酸结构比较,少一个OH,技术路线与要求,制备单链模板将单链模板与一小段引物退火加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸将4种反应产物分别在4条泳道电泳根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列,A克隆于质粒中DNA用碱或热变性BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNADPCR产生单链DNA,A高酶活性B无53外切酶活性C无35外切酶活性,ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基,5P,P5,3HO,OH3,5P,OH3,P325,5P,OH3,HO,DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,制备单链DNA,加放射性引物,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,聚合产物分别在4个泳道电泳,从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列,Sanger法DNA测序的试剂,引物酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。在许多情况下，可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。都可以采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。,模板有两类DNA可以用作Sanger法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA。采用通常从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA应中获得数百个核苷酸的序列。如用变性双链DNA用模板，则较难获得高质量的结果。尽管采用双链DNA模板的方法显然既简单又方便（Chen和Seeburg，1985），然而只是在不久前得到改进以后，这一方法才发展到能够获得明确可信结果的水平。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板DNA的质量和所用DNA聚合酶的种类。小量制备的质粒DNA常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及DNA聚合酶的抑制剂所污染，其中前两种污染物可被用作随机引物。结果，种种“鬼”带、强终止现象，以及其他假象往往使测序凝胶含混不清、黯然失色。因此采用小量制备的质粒NDA来测定未知DNA克隆片段的序列，并不可取。然而,这类DNA常可作为对已经通过另一方法测定的序列进行进一步的合适模板。采用CsCl溴化乙锭梯度平衡离心法来纯化质粒DNA，测序的结果会好得多，但却要耗费大量的人务和物力。,DNA聚合酶通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反转录酶（见文献，如Mieredorf和Prfeffer，1987）经过修饰消除了35外节酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶（Sequenase）和测序酶2.0），Tabor和Richardson，1978惟及从嗜热水生菌（Thermusaquaticus）分离的耐热DNA聚合物（TaqDNA聚合酶）。这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的DNA序列的数量的质量。,放射性标记的dNTP直至几年以前，实际上所有DNA测序反应都用32PdNTP来进行。然而32P发射的强粒子造成两个问题。首先由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上的DNA条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列（尤其是从放射自显影片的上部所读取的序列）的正确性并将制约从单一凝胶上能读出的核苷酸序列的长度。其次32P的衰变会引起样品中DNA的辐射分解，因此用32P进行标记的测序反应只能保存一两天，否则DNA将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。35SdATP的引入（Biggin等，1983）大大缓解了上述两方面的矛盾。由于35S衰变产生较弱的粒子，其散射有所减弱，凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反应中确切测定数百核苷酸的DNA序列。此外，35S的低能辐射所引起的样品分解比较轻微，因此，测序反应可在20保存至1周，而分辨率不见下降。这样，职果聚丙烯酰胺凝胶方面了发生技术故障，只要对测序反应进行重分析即可。,dNTP类似物,化学降解法测序基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.,技术路线,将双链DNA样品变为单链每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体电泳,读取DNA的核苷酸顺序,Maxam-Gilbert法所用的化学技术,化学法测序实例,哌啶,自动化测序,基本原理与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.,3730全自动测序仪,计算机排序,5,非常规测序毛细管电泳用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法.光点测序脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA3-末端时会释放1个焦磷酸(PPi),焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列.,DNA芯片测序基本原理将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序.,利用基因芯片进行杂交测序的原理,序列的组装,随机测序与序列组装随机测序也称”鸟枪法”.序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸.优点:不需预先了解任何基因组的情况.,A,B,C,A,B,C,A,B,C,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,鸟枪法(Shotgun)测序的问题,CAATGCATTAGCAGCCAATGC,GAP,错装,实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装,超声波打断纯化的基因组DNA琼脂糖电泳收集1.62.0Kb的区段、纯化构建到质粒载体中随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11631485bp组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群,各重叠群间仍有间隙顺序间隙物理间隙,载体或宿主菌选用不当而被丢失的顺序,测序时遗漏的测序,解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库,解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库,一、科学发展与社会需求之间的关系：HGP计划原定于2005年完成，而实际上到2003年就完成了，原因何在？,二、分析化学的新发展：分析化学正在向生命科学领域渗透。-金钦汉（吉林大学博士生导师）,些许思考：,三、DNA测序的研究工作,历经了数十年,成绩辉煌,曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家更大的创造力！,Thankyou!,Shotgun测序,DNA整体,切成小段,小段和载体结合,进行扩增、测序,片段重叠排序,三未来的测序技术,对现有技术的改进主要包括：(1)在自动测序仪内增加每块胶上的脉道数。(2)改进软件分析系统，提高对增加泳道和延长DNA片段初始荧光数据的分析能力。(3)采用新型凝胶电泳技术，提高条带的分辨率，扩展单反应数据范围。(4)改进光学检测系统，开发新型荧光标记，提高检测的灵敏度，降低对模板数量及质量的要求。(5)采用自动加样系统，提高加样质量和速度。,未来的测序技术主要包括：质谱法(massspectrometry)；杂交测序法(seguencingbyhybridization,SBH)；单分子测序法(single-moleculeseguencing)；扫描隧道显微镜(atomicprobemicroscopy）；超薄水平凝胶电泳技术(HorizontalUltrathinGelElectrophoresis,HUGE)；毛细管电泳法(capillarygelelectrophoresis,CE)；芯片技术等。,快速、简便的DNA双循环测序法邓兵、王宁遂、朱静、张锦中华血液学杂志(1994.09)人类基因组研究人类认识自身的跨世纪工程章彤、陈赛娟、陈竺自然杂志(1995.02)杂交测序-DNA测序新技术陈尚武、马涧泉生命的化学(1995.02)概述DNA测序技术的现状及进展邓炜、柴建华生命的化学(1995.06)大规模DNA测序进展余才林国外医学.遗传学分册(1996.02)一种简便的双链DNA测序法袁汉英.、李纹、李育阳遗传(1996.06)发展中的DNA测序技术赵晓娟、刘金毅、蔡有余、琦祖和生物工程进展(1997.04)“人类基因组计划”研究进展综述李晋楠浙江师大学报(自然科学版)(1999.03),参考文献：,发展中的DNA测序技术赵晓娟.刘金毅.蔡有余.琦祖和生物工程进展(1997.04)未来五年人类基因组研究方向给我们的启发刘志红.黎磊石肾脏病与透析肾移植杂志(1999.02)DNA测序技术新进展王强.罗伟.国外医学.临床生物化学与检验学分册(2000.05)人类基因组计划二期五年目标的焦点DNA测序房海燕.夏家辉.国外医学.遗传学分册(2000.02)DNA测序中的一些常见问题和对策贺光.邱广蓉.孙开来.中国医科大学学报(2002.05)377型DNA测序仪常见问题解析黄庆.张雪.府伟灵.医学信息(2003.07)DNA测序模板的制备和测序引物设计中的相关问题王虎.王晓健.甄一松.邹玉宝.郑维越.张芊.中国分子心脏病学杂志(2004.01),杂交测序法(SBH)：,应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上的互补序列，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定。,12-mer的靶DNA序列：AGCCTAGCTGAA,靶DNA的互补序列,运用八聚体探针,微型高密度寡核苷酸点阵的制备,详解：,本发明把生成DNA分子核苷酸碱基顺序的方法与一种超敏感的银染方法相结合，提供一种新的DNA序列测定方法及试剂盒。这一新的技术组合使电泳分离的序列片段不依赖于仪器就直接可见。这种无放射性的系统包括通过用酶促双氧链终止反应形成一系列DNA序列片段，凝胶电泳分离这些片段，并把凝胶浸入超敏感的银染溶液中,观察引物延伸产物的银染条带,从而确定DNA分子的序列。,4.2限制测序,限制测序：是指将一段染色体区段的DNA顺序进行组装.一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法.如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群,先进行各个BAC克隆的随机测序,再进行序列组装；水稻基因组测序计划采取得策略与此相同.,4.3指导测序与序列组装,建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”,即所谓”指导鸟枪法”或”指导测序”。在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法，其基本步骤如下:A构建平均为2Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序;B构建平均10Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序,读取2个端部顺序;C参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行序列组装，排成重叠克隆群.,先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb),利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig),分别测序后拼装.这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.,A,B,C,A,B,C,大片段contig,小片段测序拼装,两种策略的比较,鸟枪法策略指导测序策略不需背景信息构建克隆群(遗传、物理图谱)时间短需要几年的时间需要大型计算机得到的是草图(Draft)得到精细图谱,4.5其他测序路线,重要区域优先测序人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序.如:人类主要组织相容性复合区位于第6号染色体,与人类免疫系统有关，因而优先测序.,EST(Expressedsequencetag)测序EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很容易从cDNA文库中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其基因组的基因序列.优点:AmRNA可直接反转录成cDNA,而且cDNA文库也比较容易构建;B对cDNA文库大量测序,即可获得大量EST的序列;CEST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因;,第三节基因组测序技术,一、测序流程构建生物基因组文库或cDNA文库DNA的提取和制备酶切制备克隆用DNA片段与载体连接转化受体细胞筛选鉴定扩增培养。2.从基因组文库中提取DNA大片段，进行测序：将DNA用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序的小片断(200-500bp)小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增（或用PCR扩增）从细菌中提取出繁殖好的质粒酶切，制取测序的DNA片段3.测序：上测序仪测序。4.利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。,二、测序的基本方法,在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。,（一）Maxam-Gilbert的化学降解测序法,该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。,测序步骤：先用限制性内切酶把DNA切成100200bp的测序材料；用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5末端上的磷酸；在5-OH端标记32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；标记片段变性为单链；化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA，产生一组长度不等的DNA片段；经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。,Maxam-Gilbert测序法的特异断裂,AT,ATCGAT,SpecificReactiontoG,化學法,無放射線片段不能顯像,G反应：DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应：甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。T+C反应：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。C反应：在