nature-一篇文献的翻译《生物催化工程的第三次浪潮》

生物催化工程的第三次浪潮过去的十年里，由于科技的进步，无论是实验室还是工业规模都已确定用具实用性并且环保的生物催化来代替化学合成中的传统的金属催化和有机催化。DNA测序以及基因合成的关键进展是基于剪切生物催化剂通过蛋白质工程和设计，及将酶整合入新的生物合成途径的能力取得的巨大进步。为了突出这些成就，在此我们讨论了以酶催化作为关键步骤，将蛋白质-动力学生物催化剂应用于从通用化学品到先进医药中间体的范围。生物催化是对合成化学中微生物和酶的应用，作为自然界的催化用于新的目的：酶的应用还未涉及到1-5。通过几次技术研究创新的浪潮，目前生物催化领域已达到其企业成熟水平。图1酶发现的进程及用于确定所需催化剂的蛋白质工程策略理性设计（b）基于蛋白结构（a）或是同源模建识别不同的突变位点，而随机突变（c）与筛选或是选择结合是定向进化实验的基础。结合这些方法使构建更小型但更智能的数据库（d）成为可能。现在通过富集培养（e）对酶进行传统筛选已被关键的主题数据库检索（f）代替以指导新型酶或是他们具备的所需特性的确定。在其初期仍是酶的设计（g）的从头计算（从头合成de novo）。内部结构指的是通过生物催化不同的浪潮可得到的进行化学物质。（R)-苯乙醇腈（左）在100年前的植物提取物中已经获得；（1S,3S)-3-氨基环己醇（中）由Novartis公司利用一种固定化酯酶制成；6-氯-2,4,6-3脱氧-D-赤型六吡喃环（右）由DSM用一个设计的醛缩酶耐受高浓度乙醛并且获得高选择性的过程制的。生物催化的第一次浪潮（图1），始于一个多世纪以前，科学家认识到活细胞的组成成分可以应用于有效地生物转化（相对于几千年已经司空见惯的发酵过程）。例如，Rosenthaler利用一种植物提取物从苯甲醛和氰化氢合成的（R)-苯乙醇腈6；发生在微生物细胞内的类固醇的羟化7也已知。较新的例子即洗衣粉中蛋白酶的利用8。葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为更甜味的果糖9，青霉素G酰基转移酶制备半合成抗体10。这些应用关键挑战在于生物催化剂稳定性的限制及诸如此类的缺点主要通过酶的固定化来克服，这也有利于酶的重复利用。生物催化的第二次浪潮，在20世纪80到90年代，最初的蛋白质动力学技术，代表性的即基于结构的技术，扩大了酶的底物范围以允许异常的合成中间产物的合成。这一变化将生物催化扩展到医药中间体和精细化学品的制备。实例包括脂肪酶催化水解手性前体用于合成地尔硫卓（一种治疗血压药物），醇腈酶催化合成醇类对映异构体应用于降胆固醇抑制素药物，脂肪酶催化合成蜡酯类物质例如肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯或是十六烷基蓖麻醇酸酯用于化妆品工业，以及腈类水合酶催化水合丙烯腈形成丙烯酰胺用于高分子材料（这类腈类水合酶已在紫红红球菌全细胞中获得）。除固定化之外，目前的挑战包括优化用于非天然底物的催化剂。现阶段，生物催化的第三大浪潮开始于20世纪九十年代中后期Pim Stemmer 和Frances Arnold的工作。他们首创了分子生物学方法，通过达尔文进化论体外实验快速大量地修饰催化剂。尽管这一术语于1972年的全细胞实验中曾被用过，现在这一方法通常称为定向进化，这一技术的最初方法涉及到在一个蛋白质中氨基酸的随机突变的迭代循环法，随后从酶稳定性提高，底物特异性以及对应选择性的突变体形成的库中筛选法。讨论到此，今后的发展已经集中于提高定向进化的效率以产生“更智能地”数据库。工业生物催化主要集中于水解酶，一些酮还原酶（KREDs），以及辅因子再生和在有机溶剂中蛋白质的稳定性研究。在某些情况下，优化代谢途径；例如，融合不同的自然界菌株的基因于一个新的宿主细胞以产生1,3-丙二醇（形成多聚体的单体），使得将甘油转变为更易被利用的原料葡萄糖成为可能。由于现在的生物催化浪潮取得的进展，将酶设计成引人瞩目的新功能，例如接受之前的惰性基质（孟鲁司特的KRED或是西他列汀的转氨酶），或是改变形成产物的性质（萜环化酶突变体可作用于不同的萜烯或是氨基酸代谢物使醇类作为生物燃料）。如今需要新型酶将生物量转换为第二或第三代生物燃料，材料和化学品。第三大浪潮的主要发展是先进的酶工程（包括定向进化），基因合成，序列分析，生物信息工具和计算机模拟，并且酶改进的理论进展可能比原来预期的要更显著。工程酶可以在含有60uC的有机溶剂的溶液中保持稳定，可以接受新的底物以及催化新的非天然反应。目前这一工程可能需要几个月，这样大大扩展潜在的应用。过去，设计酶化的过程受到酶的限制；目前，酶设计逐渐适应工艺规范。大约十年前，Nature和Science的文献综述了第一次和第二次生物催化浪潮，提出了可能带来的第三次浪潮的提示。现今及时评估第三次浪潮的影响及推测未来十年可能的带来什么进展（框1）。尽管生物催化涉及到代谢工程和合成生物学，但这些综述重点是针对酶法和全细胞反应。框1 生物催化应用要求及实例l 传统的生物催化，天然产物采用自然反应和途径转变成其他天然产物。技术要求：尽可能控制自然生物转化；实例：面包和奶酪制作，皮革加工，啤酒和酒发酵，及天然抗生素生成。l 宽底物范围生物催化，化学中间体（非天然产物）通过自然反应和途径转变成其他化学中间体。技术要求：特定酶的使用（没有干扰活性存在）；概念要求：许多酶具有宽的底物范围；实例：采用酯酶和羰基还原酶（乙醇脱氢酶）生产医药中间体。l 多级生物催化，天然产物通过非自然反应和途径转变成燃料，材料和化工原料（非天然产物）。技术要求：蛋白质工程主要用于稳定性，底物范围和催化反应类型的改变；概念要求：酶可以催化非自然反应，酶的新的组合产生新的途径；实例：用异戊二烯生物合成途径生成燃料分子，氨基酸生物合成燃料乙醇。适应酶工程的制造工艺为了最大限度降低成本，化工业需要在希望的工艺条件下产生稳定的，选择性的及高产的催化剂。这样的加工的酶设计先要确定设计目标，例如增加稳定性，可选择性，底物范围，或是通常这些性质的结合。2000年，第三大浪潮前，只有很少的策略可以满足这些目标。酶的固定化可以增加蛋白的稳定性，但是稳定性的增加幅度较温和而且往往不能满足大多数化学转化。定向进化也有可能满足这些目标，但仍然缓慢，因为它需要对大型数据库进行建立和筛选，而且这些数据库中大部分突变体是活性降低甚至没有活性的。大幅改进的例子很少与产业相关。低速意味着进化的蛋白仅包含一些变化，因此，酶性质仅稍微得到改变。尽管几百年来酶法工艺已经应用于工业，但大部分设计的酶和全细胞从遗传学上已被最低限度的改变了。流程设计标准（一个或一些或全部）所需性质改变的定量检测l 生产过程中的高活性l 稳定性增加l 热稳定性的最高温度增肌l 对有机溶剂稳定l 底物缺失和/或产物抑制l 储存和运输热稳定性增加l 选择性提高（对应选择性、位置选择性、化学选择性）l 作用新底物l 催化新反应l G蛋白质设计目标对蛋白质力学和动力学的理解l 未折叠酶不稳定l 折叠酶稳定l 增加底物结合l 阻止多余底物l 重塑底物结合位点l 添加主要力学过程l G蛋白质设计策略（氨基酸变化）结合计算机模型的结构模型设计l 构建空间位阻l 添加氢键和离子对l 通过形成环降低或增加柔性（熵）l 疏水相互作用l 蛋白质多样性策略（氨基酸变化）更可取的分子但并非必须l 通过随机突变，定点突变，定点饱和突变，转基因等得到突变体l 接近反应条件的条件下进行检测l 采用生物信息学工具如ProSAR优化确定提高适应性的突变体或是氨基酸替换核酸和基因组优化（沉默突变，非编码区变化）l 提高目的基因转录效率（超表达，高保真）l 增加mRNA稳定性l 提高mRNA翻译效率l 调整启动子长度l 改进核糖体结合序列l 增加适合有机体酶生成的密码子的使用l 当需要合适的折叠时增加密码子使用以加速或降低翻译l 敲除催化底物或产物副反应的酶的密码子或是讲解目的酶图2通过蛋白质工程策略结合自由能（G）设计目标所需的结构改变这一推理需要利用更集中的数据库。如果设计目标并非在于开始酶的作用，那么大变化的自由能是必要的。对蛋白质伸展及反应机理的力学和动力学的理解确定达到设计目标的设计策略。最终，结构分析（从定性的检测到大量的计算机模拟的差异）可以确定必须改变的区域和氨基酸。需要高的自由能变化的目标将同样需要结构上更广泛的变化。过去的十年里，我们对蛋白质和有效地定向进化策略属相的理解都加深，可能酶学性质发生巨大改变。总的来说，酶工程仍将是通过运用各种解决目前问题可能的方法，对研究成果进行收集，而不是例如用在那些土木，电器，软件或是化学工程的学科的定量的方法。这些实验研究转化为动力学原理将需要运用自由能与设计目标产物结合成需要的结构变化（图2）。性质的巨大转变需要自由能的较大转变。例如，稳定性的明显改变将需要折叠-伸展平衡时更多的自由能变化。（甚至蛋白质不可逆的伸展起始于一个可逆的部分伸展。）对蛋白质分子生物学的理解暗示着策略可得到改善。例如，表面残基促进折叠-伸展平衡，并且在环区增加一个脯氨酸会降低伸展形式的熵。这些策略代替了随机突变（大部分具有更差的性质）巨大的数据库，而是包含高比例具有活性且潜在的改进的突变体组成的更小的，更集中的蛋白质数据库（图1）。最后，通过估算各种反应（表面离子对或是增加脯氨酸对熵变的贡献）的强度，研究者可以估算出达到目标所需的变化。目前很少有研究人员明确的应用基于自由能的方法来计算蛋白质自由能策略，但是将实验研究转变入动力学原理需要一种定量的方法。新的改进的方法过去的十年里，DNA技术和生物信息学主要进展已经为生物催化领域提供了关键性的支持。这些工具已经促进了自然资源中新型酶的发现，并且大体上加速了目前生物催化剂的重新设计。先进的DNA技术新一代的DNA测序技术已可以大规模且相当低成本地进行平行序列的分析。然而，2002年人类基因组序列分析的成本估计为70,000,000美元，2012年成本已大大降低了1,000倍，低于10,000美元（参考34），Life Technologies 公司，Illumina 公司和Oxford Nanopore Technologies公司已宣布能够在几个小时内对人类全基因组完成测序的测序设备的设计经在2012年晚些推出，这将使每一个基因组的成本降低至少于1,000美元。不同环境的有机体的全基因组序列，或是环境中的不可培养的有机体（宏基因组）的DNA样本，都已建立了丰富的资源，以供在其中搜索新型生物催化剂35，而且会继续进行。运用Illumina技术进行大规模的高通量测序（10,000,000序列读取）也促进了对蛋白质序列-功能关系的探索和了解36。低成本DNA合成已代替基因组DNA的分离成为蛋白质工程的开端。全基因DNA合成可以进一步为宿主生物体优化密码子，将分子总体结构例如启动子，终止子，增强子，限制性位点等引入到合适的位点。DNA合成应用传统的亚磷酰胺化学法，但是优化的反应条件已经提高了配对效率，这样增加了聚合物整体质量和数量使得序列可以甚至达到200-250个核苷酸长度。并行DNA合成应用光刻和喷墨印刷技术进一步降低成本并实现快速合成37。DNA合成也已被用于染色体DNA的整个部分甚至用于代谢途径工程的全基因组的合成38。全基因合成也可被用于合成高质量DNA数据库，范围从小型，集中，饱和位点数据库到大型，综合性的基因库。自定义的基因甚至基因库正成为类似如今研究实验室使用的试剂和溶剂的商业化化学品。生物信息学新型工具对实验进展进行补充，生物信息学工具已经成为现代蛋白质工程的一个主要部分39。大的酶家族和同源性搜索的多序列比对中已经确定具有相似催化活性的基因，导致新型的，强有力的生物催化剂40。相同的序列信息可以重建原始的生物催化剂40，它可能具有更广泛的底物范围和催化多功能性（见下文）。多序列比对确定每个位点最常见的氨基酸（共有序列）和氨基酸替换以得到功能稳定的酶。这一数据有助于具有高比例催化活性突变体的小型数据库的设计。这些数据库已被用于稳定性、催化功能增强及立体选择性改变的生物催化剂的发现41。结合基于序列的蛋白质工程的进展，结构指导的方法已经从储存在RCSB蛋白数据库（）中蛋白质结构坐标快速增加中获益。过去的十年里，资源库增加已超过450%，包括超过77,000种蛋白结构。这既有利于合理蛋白质的设计又促进定向进化，因为相关蛋白的结构比对有助于确定显著地异同，指导突变体库更可靠的设计。用两种不同的方法增加酯酶对分解一种手性合成子2-甲基-3-溴丙酸的对应选择性证明了较小型数据库的实效42，采用随机突变从成千上万的突变体中筛选出200个，酶的E值（使一种对应体转变成另一种的酶的选择性）从12增加到19（见43）。认识到得到一个实用性的（E.30）需要两个对映体间差异活化能（G+）一个相对较小的增加（0.5 kcal/mol），突变形成集中于活性位点。一个包括在四个位点出现的所有可能的单点突变（76个突变体）的数据库，可以产生一个E值561（G+50.96）的酶。了解了需要解决的问题的关键主要在于从较小型数据库中酶的优化方法以及提出更大的改进。关于此点，提出了一种相当有价值的新方法进行持续定向进化，它可用于噬菌体侵染系统与大肠杆菌重组质粒的结合44。工业生物催化中工程酶的实例据Schmid等2001年前瞻性综述预测29，过去的十年里已报道辅因子连续再生和酶的宽范围。然而，生物芯片和组合生物催化的预测应用尚未实现。非代谢细胞生物催化的使用已证明比预期要困难得多，而且这一策略已转向用于未加工和半纯化形式的工程酶。鉴于史上一种全细胞可以提供一个简单高效选择的辅因子再生以及酶稳定性增强，目前蛋白质工程和单酶的使用被认为更加经济实用。单酶的使用还用其他的优势：更易去除（加入量更少，因为每单位质量具有更高的活性），耐受更苛刻的条件，消除细胞膜造成的潜在的扩散限制，而且更容易运输到细胞各处。例如，目前基于KRED的过程代替了全细胞还原反应和基于金属配体的化学催化作用，过去的十年里这些曾是工业标准45,46。全细胞过程是一个例外，它可以将外消旋的海因转换成光学纯的，非天然存在的一种氨基酸。发现重组大肠杆菌成为一个简单高效的生产系统，同时表达海因酶，氨甲酰水解酶和消旋酶，代替了在连续的固定床反应器中，以三种固定酶酶基础的原始的加工方法47,48。此外，全细胞过程不需要代谢通量控制以及进行中没有非预期的副反应。图3阿托伐他汀（立普妥）关键侧链合成不同的酶催化途径这些途径采用KRED与卤醇脱卤酶（HHDH）的结合（途径1），腈水解酶（途径2），或是醛缩酶（途径3）。它们的区别不仅是酶的不同，也有（廉价）原材料的选择、生物催化剂活性和选择性，下游加工，以及最终产物产量和纯度。途径1,2得到一个立体中心，然而途径3可以同时得到后期医药中间体的两个立体中心52。紧接着途径1,2引进第二个手性中心也是通过应用KRED完成的。LDA，二异丙基氨基锂；t-Bu，叔丁基；THF，四氢呋喃。KREDs和其他酶都已广泛用于研究药物手性中间体的制造，例如阿托伐他汀是立普妥的有效成分，是一种降胆固醇药物，2010年全球销量为11,900,000,000美元。七种酶促途径2,49,50（图3）已成熟，其不同不仅是酶和原材料的选择，而且关于产物是否是一种物质（单一手性中心）或是晚期中间产物（两个手性中心）。在所有情况下，成功需要蛋白质工程来提高反应速率，对应选择性，高底物浓度（高达3M，例在腈水解酶过程中51）的稳定性，或高溶剂浓度（KRED催化过程中20%乙酸丁酯52）。除了高活性的生物催化剂，低成本过程也需要廉价的原料和简单的单一高产率产物的分离。通用的一种产生晚期中间产物的方法采取3步生物催化：一，KRED和葡萄糖脱氢酶的结合；二，与卤醇脱卤酶的结合以100tyr-1生成R(-)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中间物（图3）；三，晚期二醇中间产物的酶促还原反应52。最近工程17扩大了转氨酶转化为带有两个大的取代基的酮类的底物范围。酶工程从一个小的酮底物开始，在活性位点产生更大的空间，并且利用越来越多的酮类。几个循环的定向进化增加了它的活性40,000倍，并且获得一个改造的氨基转移酶（图4），其可以代替基于过度金属加氢催化西他列汀的生产。起始于ATA-117，一个与对底物未检测到活性的野生型酶高度同源的酶，第一次突变体获得非常低的活性（0.2%转化率，2gl-1底物，10gl-1酶）转化为prositagliptin；最终的突变体将200gl-1的酮转化为西他列汀转化率为92%，99.95%的旋光异构体。生物催化过程不仅降低了总体的浪费和排除了所有的过渡金属，而且相对于金属催化过程增加了53%的整体产量和生产率18。医药企业众多的生物催化路线逐渐增加（表1），显示了它们与传统化学反应的竞争力。图4生物催化推进合成化学采用设计的安吉转氨酶合成西他列汀的酶催化路线优于化学加氢反应，产生更高产量的99.5%旋光异构体光学纯产物，更高的产率，降低了整体耗费和过渡金属催化的去除17,18。Atm，大气压；e.e.，旋光异构体；Me，甲基最优化研究得到的酶突变体是未来项目出发点一种独特的来源，通过用更稳定的酶设计一种方法，下一步优化过程可以更快。例如，设计KREDs生产R3HT（3）（见表1化合物缩写和编号），得到了许多稳定的酶突变体，包括一些由于低的对应选择性不适合的酶突变体。然而，这些不合适的突变体是设计KRED用于DCFPE（4）的启动酶。然后DCFPE酶是孟鲁司特（5）KRED的起点，孟鲁司特KRED转而又是度洛西汀(6)KRED的起点。相似的，在prositagliptin(18)转氨酶进化期间产生的转氨酶，可以生成另一个胺类，可能作为胺合成的新的工表1医药行业最近成熟的生物催化过程（见原文）表2十年里生物催化获得的总统绿色化学挑战奖产品技术公司年琥珀酸作为化学原料发酵BioAmber20111,4丁二醇为聚合物和化学原料发酵Genomatica2011高级醇类作为燃料和化学原料发酵UCLA (Prof. Dr J. Liao）2010来自脂肪酸的代谢中间产物的可再生石油发酵LS92010西他列汀：治疗2型糖尿病的医药原料酶Merck and Codexis2010用于化妆品及个人护肤品的酯类酶Eastman Chemical Co2009用于治疗高胆固醇症阿托伐他汀中间体酶Codexis2006用于生物降解塑料盒化学原料的聚羟基脂肪酸发酵Metabolix2005人体营养凡是脂肪和油脂酶ADM and Novozymes2005鼠李糖脂：基于生物的生物降解工业表面活性剂发酵Jeneil Biosurfactant Company2004治疗乳腺癌的紫杉醇发酵Bristol Myers Squibb2004运用酶去除粘性污物提高纸张的循环利用酶Buckman Laboratories International2004利用酯酶的聚合酯合成酶Polytechnic University (Prof. Dr R. Gross)20031,3-丙二醇合成高分子发酵Dupont2003乳酸合成聚（乳酸）聚合物发酵NatureWorks2002制成纤维前去除棉花中天然蜡状物和油脂酶Novozymes2001程酶的起点。从非天然存在的稳定的以在过程中起作用的酶突变体开始，从而以前所未有的方式加速了催化剂及反应进程。同时设置两个立体对映中心的酶的转化是生成复杂分子相当高效的方式。例如，KRED催化酮类还原反应设置醇类立体对映中心。然而，如果紧挨着酮类羰基第二个立体中心在溶液中迅速的发生外消旋反应，KRED对一种构型具有高度选择性，那么这个还原反应可以一步设置两个立体中心。包括青霉烯中间体（8）伪麻黄碱（12）以及福林（13）的实例，还有手性胺（20）相似的反应。此外，醛缩酶目前被用于随后的反应步骤以生成多个手性中心，例如，在他汀类中间体（33）的合成。随着醛缩酶催化作用，单酶级联反应已进一步扩展到多酶级联反应，例如在2-脱氧肌苷（34）体外合成或是像青蒿素（42）或紫杉醇的复杂分子体内的合成。生物催化进程的环境优势在化工业环境方面担忧的背景下，生物催化提供了具有吸引力的选择。美国环保局在每年的总统绿色化学挑战上奖颁发五个奖项。提名强调绿色化学的12项原则53，考虑了环境因素以及再生原料的利用、能源效率和员工安全防护。或是利用酶技术或是全细胞的生物催化自从2001年已获得16项奖（表2）。生物催化剂来源于再生能源，是生物可降解的，无毒性的，并且其高选择性简化了反应分离净化实验，高产生成产物。生物催化反应也是安全的，因为其一般在室温，大气压和中性pH条件下进行。因此，生物催化获得许多奖项并不奇怪。表2中奖项的广泛范围显示了生物催化剂在医药行业以外的应用。有些应用涉及到聚合物尤其是多元酯。乳酸的优化发酵是内布拉斯加州每年141,000公吨生产力的聚乳酸厂的基础，新的非天然存在的代谢途径可进行1,3-丙二醇Sorona聚合物加工。1,4-丁二醇发酵生成另一种聚合物组分氨纶。聚羟基脂肪酸的合成过程中，生物催化剂催化不只是单体的合成还有它的聚合物。Yang与其同事最近设计聚羟基脂肪酸合成酶使乳酸聚合成聚乳酸54。其他一些奖项涉及到加工生物燃料的新的代谢途径。例如，LS9公司设计的大肠杆菌生产生物柴油。将植物硫酯酶基因整合到大肠杆菌将正常的脂肪酸生物合成转变成适合用于生物柴油的脂肪酸的合成。然后，将基因整合进去为了使酶作用生成乙醇，使酶结合乙醇和脂肪酸生成脂肪酸乙酯，可用作生物柴油22。生物柴油的产量至少十倍，对商业可行的加工仍很低，但是进一步设计将会增加产量。蛋白质工程的新概念酶性质较大变化通常需要多个氨基酸的替换，因为它们可引起蛋白质结构的较大的改变。然而，多个氨基酸同时替换形成指数增长的更多的突变体需要检测。一个200个氨基酸的蛋白质任意两个同时替换就有7,183,900种可能，任意三个同时替换就有9,008,610,600种可能。许多这些突变体是无活性的，而且要么对产生的所有的突变体进行检测以发现活性提高的突变体，要么仅筛选部分数据库并且需要随后的进化循环增加优化的酶。最简单的解决方法是更有效地筛选。底物特异性的改变可能通过高通量的方法进行检测，例如荧光激活细胞分选55-57，可以在很短的时间里筛选数以百万的突变体。Whittle 和Shanklin 在一种脱氢酶的活性位点同时替换六个氨基酸，然后筛选出一种不同底物存在的生长菌体。仅有一些突变体底物特异性改变的菌体可以生长58。Seelig 和Szostak 从非常大的随机数据库（多达1013个突变体）中筛选出的突变体可以催化RNA基于与产物结合而不是原材料的连接成一列59。目前，得到多个突变体最好的办法是将它们同时整合，仅用统计学或生物信息学方法限制其选择。统计相关性方法是基于用ProSAR(蛋白质结构活性关系)算法，Codexis研究人员用其提高卤醇脱卤酶的反应速率4,000倍60。研究人员用得到的脱卤酶的氨基酸随机替换（平均十个），测量突变体的催化速率。然后用统计学方法确定特定的替换是否是有益的。例如，包含Phe186Tyr的突变体通常比不含此突变的更有益。一些含有这样的替换的突变体没有效用，是因为其他突变体的不利影响。但是统计分析表明，通常Phe186Tyr是有利突变。最终改进的酶254个氨基酸中包括35个氨基酸替换。-蛇麻烯合成酶催化法尼酰基二磷酸的环化，经过阳离子中间体其中45%生成-蛇麻烯，但是形成少量的51种其他的倍半萜烯。Keasling及其同事将活性位点的氨基酸残基逐步进行替换，确定了每一个残基对产物分布的贡献61。其他倍半萜的其中一种的有助形式与替换结合。例如，一个三重替代得到的酶生成78%的sibirien；天然存在的酶只生成23%的sibirien。另一种方法是限制活性位点变化的位置和那些已知来自序列对比在这些位点经常发现的变化的类型。 Jochens 和Bornscheuer 用这种方法增加了荧光假单胞菌酯酶的对应选择性。有160,000（204）种方法同时改变底物活性位点四个邻近的氨基酸。研究人员对比2,800个相关酶的氨基酸序列确定哪些氨基酸是这些位置最常见的。这一分析限定了数百种突变体的可能性，检测发现其中具有所需选择性的两点突变体和三点突变体41。另一个多点突变重要的优势是因为突变常使蛋白质不稳定62-64，因此从一个相当稳定的蛋白质开始使得其可以耐受数量更多范围更广的变化65,66。因为筛选包括多点突变的较大数据库的工作量随着数据库的大小成指数增加，大部分研究人员从事于有利突变通常是累加的67，除了邻近的变化以外协同效应很罕见的假说。事实上，结合有利的单点突变体通常得到累加提高（例如枯草芽孢杆菌酯酶在有机溶剂中稳定性的增加68或是铜绿假单胞菌中脂肪酶对应选择性的提高）。然而，通常这些贡献不能完全累加或是获得出乎意料的特性。例如，突变体A和B本身可能都是有害的，但是两者结合可能是有利的。Weinreich及其同事70研究具高活性的-内酰胺酶进化中协同相互作用。突变体A提高反应速率而降低-内酰胺酶稳定性。整体效果只是稍微改善。突变体B不影响速率但增加稳定性；对其本身没有作用。突变体A和B结合具有显著地改善因为-内酰胺酶作用更快，并且保持其稳定性，但是增加了突变体将逐步地尽可能地失去协同的这些作用。Reetz 和Sanchis 得出类似的结论，在检测突变体的逐步累加可增加对应选择性71。当其中一个突变体是稳定的突变体而这些突变体在其附近时，协同效应非常重要。由于基因突变前蛋白质的稳定性可以使稳定突变的非累加性的复杂性最小化，但由于附近突变的非累加性的复杂性是常见的，很难避免。因此，蛋白质改进中造成有利变化的范围在过去十年里大幅增大。21世纪00年代早期，1-5点突变体是典型的，而到2010年，30-40氨基酸替换已变得平常。例如，为改造阿托伐他汀（立普妥）侧链（图3），对卤醇脱卤酶进行定向进化对254个氨基酸改变了至少35个60(14%)，为改造西他列汀（图4），对转氨酶进行定向进化330个氨基酸改变了27个17（8.2%）。类似的，计算机设计的逆醛缩酶需要原酶8或12个氨基酸替换（4-6%），这是一个由197个氨基酸组成的木聚糖酶72。过去十年里研究的另一种方法是新型，往往是非天然的，催化活性的创造。这个新活性的出发点通常是一个催化混杂的反应。催化混杂性一个活性位点具有催化不止一种催化类型的能力。通常情况下，酶催化一个正反应及额外的副反应，可能会涉及到共同的催化步骤。新的反应类型不只是取代基添加到底物上，还涉及到不同的过渡态和/或形成不同类型的化学键。例如，丙酮酸脱羧酶通常将丙酮转化为乙醛和二氧化碳。然而，丙酮酸脱羧酶的混杂催化活性是在酮醇缩合反应中乙醛和另一个乙醛的结合。这样一个非天然存在的丙酮酸脱羧酶催化的乙醛苯甲醛的缩合是BASF公司20世纪90年代发展起来制造药物麻黄素前体的工业生成过程的基础。最近，蛋白质工程加强丙酮酸脱羧酶催化酮醇缩合的混杂性的能力73。正常反应需要一个质子转移，但混杂反应不需要。单个氨基酸替换去除一个质子供体使正常活性缺失而混杂活性增加了约5倍。这种缺失不必要的途径而增加所需产物的通量的方法通过第三次浪潮先进的代谢途径工程得到进一步发展。这使得次级代谢中更复杂的途径转变成创造新型生物体和全新生物化学途径成为可能，来生成医药中间体和生物燃料。萜类，氨基酸以及脂肪酸的正常代谢都已被重新设计以生成烃类，醇类及多聚酯用作燃料，散装化学品和塑料（见上文）。生物催化工程存在的挑战尽管有所进展，充分利用生物催化的优势仍存在重大挑战。酶工程发展速度远远超过十年前，但改变30-40个氨基酸并筛选数以千计的候选突变体仍需要大批的研究队伍。即使不是全部，也有许多设计策略将产生改进的突变体，而一些则将产生更有利的突变体而且更快的找到它们。那些策略是更具优势的让不清楚。对这些策略遇到相同的问题进行对比，验证不同策略背后的假设将会找出最有效的一种。第一个假设是利用酶工程可以达到目标。涉及到非天然存在底物的热力学反应可能比涉及到天然底物的反应更不利进行，并且获得某种酶的活性可能是热力学不可能的。扩散设置了反应速率的上限。热力学与生物催化过程紧密结合的发展是设计新方法更加可取的。蛋白质工程往往依赖已知的酶的四级结构，因为蛋白质-蛋白质界面的残基可影响到其稳定性。研究人员认为反应条件下的酶的结构（低浓度酶，高底物浓度，有机溶剂等）与晶体酶的结构（高酶浓度，无底物和/或有机溶剂）是极其相似的。因为蛋白晶体只在大量实验中狭窄的条件下发现，在溶液中除了晶体结构中看到的构想外，它们可能具有许多构想。另外，我们对蛋白质动力学的理解仍非常有限，而且使预测变得困难。第三，酶工程假定个别突变是累加的67。尽管突变体大多是没有相互作用的，但许多相