等温滴定量热法.ppt

等温滴定微量热法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC),林杰,2,ITC,Isothermaltitrationcalorimetry(ITC)isusedtomeasuretheheatadsorbedorreleasedduringchangesinthecompositionofasystemundergoingatitrationprocess.等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化,3,history,builtinthesecondhalfofthe1960stostudychemicalreactions.Duringthe1970s,thesensitivityofinstrumentswasintherangeofmJ,andotherfirstapplicationsweredevelopedsuchasthestudyof(metal+ligand)complexes8andtheadsorptionofaromaticcompoundsbymolecularsieves.In1980s,thesensitivitywasimprovedtoJrange.Newapplicationsinthe1980swererelatedtobiology,biochemistryandphysicalchemistrysuchasthestudyofligandbindingprocessesandmicelleformation,灵敏度的提高,4,history,Sincethebeginningof1990s,thenumberofpublishedpapersrelatedtoisothermaltitrationcalorimetryhassymptomaticallyincreasedduetorapiddiffusionofnewcommercialcalorimetersinthescientificcommunity.,5,history,Duringthedecadeof1990,isothermaltitrationcalorimetryhasevolvedfromaspecialistmethodtoawidelyusedtechnique.Duringthe2000s,isothermaltitrationcalorimetrywaswidelyemployedinthedesignanddiscoveryofdrugsandinadditiontothis,inthislastdecadeanisothermaltitrationcalorimeterwithopencellwasemployedforthestudyofliquidmixtures.,6,ITC,7,在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。,8,上图：横坐标：时间纵坐标：热功率峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。下图：横坐标：滴定物与样品溶液的摩尔比纵坐标：滴定产生的总热量反应过程的结合等温曲线,图形,9,ITC可以直接测量焓变H，结合常数Ka，而不对反应体系产生影响，也不引入修饰基团，因此测得的结果更加可信,典型的ITC数据配体溶液20次注射到ITC池的蛋白溶液中。每个注射峰（上图）下方的区域与注射所释放的总热量相等。当这种综合的热量相对添加到池中的配体摩尔比作图时，就获得了相互作用的完整结合等温线（下图）。用单位点模型来验证数据。化学计量、结合常数及焓的数值都显示在框内。,10,流程,1、确定合适的反应物浓度2、准备样品3、滴定收集数据4、校正后的数据非线性回归得到热力学参数5、分析模型,11,模型分析,正确理解反应过程首先要理解模型给出的各种参数的正确意义。根据模型给出的各种热力学参数确定反应的相关性质。,结合位点数不同，平衡常数的物料平衡的表达公式是不同的,12,13,characteristics,它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（H）、摩尔结合熵（S）、摩尔恒压热容（Cp），和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat）,用来表征生物分子间的相互作用。,14,独特特点：,样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2-80，滴定池体积(1.43ml)。实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析ITC得到的数据)。测量时不需要制成透明清澈的溶液,而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、介电常数、溶剂强度、光谱性质和电学性质以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。,15,药剂学方面的应用,weinvestigatedtheinteractionsbetween-CDandthetwoguestmoleculesbymeansofisothermaltitrationcalorimetry(ITC),16,ThesamplecellwasloadedwithaqueoussolutionsofmPEG5k-ad(0.5mM)andmPEG5k-chol(0.1mM),respectively.Titrationswerecarriedoutbystepwiseinjectionof-CDsolutions(5mM)intothesamplecell(5mlperinjection,60sinterval).Allmeasurementsweredoneat250.1Cand370.1C.,17,18,Theinflectionpoints,whichreflectthestoichiometryoftheformedcomplexes,areclosetooneincaseofmPEG5k-adindicatingthateachadamantanegroupisassociatedwithone-CDmolecule.Thisisinagreementwithotherreportsshowinga1:1bindingstoichiometrybetweenadamantanederivativesand-CD.IncaseofmPEG5k-chol,thestoichiometrywasclosetothree,whichhadalsobeenreportedpreviously.Thehigherorderofcomplexationmaybeduetoself-associationofcholesteroland/orpartialinclusionofthecholesterolsidechainintothe-CDcavityWefoundthatmPEG5k-cholexhibitedahigherbindingaffinitythanmPEG5k-ad,19,Applicationsinclude:,Characterizationofmolecularinteractionsofsmallmolecules.表征小分子的相互作用Le