Ⅰ顺铂-聚谷氨酸复合物药物修饰系统的建立及应用-Ⅱ基于RCAS-TVA系统的小鼠乳腺癌发病模型的建立及应用

顺铂-聚谷氨酸复合物药物修饰系统的建立及应用 基于RCAS-TVA系统的小鼠乳腺癌发病模型的建立及应用【摘要】：恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命,对于肿瘤发病机制及抗肿瘤药物的开发已经投入了大量的人力、财力和物力。顺铂(cisplatin,CDDP)是目前临床上化疗的首选药物之一,具有抗癌活性谱广,杀伤作用强等优点,然而研究表明：铂类抗肿瘤药物属周期非特异性药物,半衰期长,溶解度低,细胞毒性大,无靶向性,大大限制了其在临床上长期和高剂量的使用。因此,研究和开发低毒高效的顺铂类似物,一直是药物修饰领域的研究热点。随着材料科学技术的发展和应用,高分子聚合物作为药物载体的研究越来越多,基于肿瘤组织内部特有的高通透性和滞留效应(EPR效应),高分子药物载体通过与药物的相互作用,可以提高药物的水溶性,改善药物的药代动力学特性,调控药物在组织中的分布,靶向给药,降低药物的毒副作用或药源性疾病等,对于提高药物的安全性和稳定性具有很高的应用价值。枯草芽孢杆菌发酵来源的型聚谷氨酸(-PGA)就是一种良好的药物载体,它具有结构单一、制备工艺简单、良好的生物相容性和生物可降解性、良好的缓释和控释性能等优点,近年来,以y-PGA作为载体的研究备受关注。基于以上研究背景,为开发一种半衰期长、毒性低、具被动靶向和缓释效果的顺铂类似物,我们将顺铂巧妙地连接到生物发酵合成的-聚谷氨酸药物载体上,制备顺铂-聚谷氨酸复合物(-PGA-CDDP),在实验室原有研究基础上,进一步研究该复合物的性质；将其与临床常用化疗药物进行比较；并制备-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物(GlutamineAspartatePolymers,GAP460)以提高药物载量。具体研究内容和结果分为以下两个方面：(1)枯草芽孢杆菌发酵制备-PGA,通过优化反应条件,制备-PGA-CDDP复合物,并借助红外吸收光谱和核磁共振的方法对复合物进行表征鉴定。为系统研究y-PGA-CDDP复合物的性质和生物学活性,将该复合物与临床常用化疗药物顺铂、卡铂和奥沙利铂进行比较：以Bcap-37、BEL-7404和SH-SY5Y三株人源肿瘤细胞为例比较四种药物的细胞毒性和半抑制浓度(IC50)；模拟药物体外释放曲线；以正常昆明小鼠和BALB/cA荷瘤小鼠为动物模型,比较药物作用后的抑瘤效果、体重变化、存活率；白细胞(WBC)、血小板(Platelet,BP)等血液生化指标；肌酐(CRE,CREAP)、尿素氮(BUN,UREA)、髓质过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等肾脏毒性指标,结果证明：-PGA-CDDP复合物在细胞水平上不仅可以显著抑制Bcap-37等三株肿瘤细胞的增殖,而且大大降低了细胞毒性,表现为IC50值明显高于顺铂,与奥沙利铂相当,略低于卡铂；在BALB/cA荷瘤模型动物体内,-PGA-CDDP复合物可以有效抑制体内肿瘤的生长,相同实验条件下,其抑制作用效果与顺铂相当,优于卡铂和奥沙利铂,同时药物的毒副作用大大降低；在昆明小鼠体内,-PGA-CDDP复合物对于动物的损伤最小,顺铂等化疗药物作用后,均可不同程度的引起体内WBC和Platelet数目下降、CRE和BUN含量升高、MPO和MDA上调、GSH和GSH-Px下调,而-PGA-CDDP复合物作用后,动物体内各生化指标均保持稳定,肾组织氧化性损伤显著改善,在与临床化疗药物的比较中体现出明显的优势。(2)-PGA的药物载量偏低,高剂量药物治疗时载体用量较大,另外,y-PGA在体内的代谢过程可能导致神经递质前体的累积,本实验室研究发现,-PGA-CDDP复合物的载药量只有14.6%。为解决上述问题,通过酰胺化反应,制备GAP460复合物药物载体,并以顺铂为例,研究顺铂-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物(PACC)的性质和功能,结果证明：GAP460复合物药物载体在37、pH6.0-7.4的环境下保持稳定,温度的升高、偏酸或偏碱的环境均可使GAP60复合物发生不同程度的降解；急性毒性实验,单次静脉注射GAP460复合物4.0g/kg动物存活率为100%,单次静脉给予2.0g/kg,动物的体重,体内白细胞(WBC)、血小板(BP),血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、肌酐(CREAP)和尿素氮(UREA)的含量均保持稳定,药物载体安全无毒；相同实验条件下,GAP460复合物的药物载量为38.52%,约为-PGA药物载体的3倍,药物载量的提高可大大减少载体的用量,并改善药物的控释效果；PACC复合物不仅在体外可以显著抑制Bcap-37等肿瘤细胞的增殖,IC50值明显高于游离顺铂,而且可以有效抑制BALB/cA荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长；同时,PACC复合物大大降低了体内毒副作用,用药后动物体重无明显下降,肾脏功能和肾脏氧化性损伤得到明显改善。综上所述,本文将-PGA-CDDP复合物与临床常用化疗药物开展系统比较研究,并引入天冬氨酸分子对聚谷氨酸药物载体进行改造,为高分子药物载体和-PGA-CDDP复合物的临床应用提供了有益的探索。癌症是危害人类健康甚至危及生命的重要疾病之一,而恶性肿瘤的侵袭和转移又是癌症预防和治疗的难点。据统计,乳腺癌的发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%,并呈逐年上升的趋势,乳腺癌的预防和治疗已成为研究热点。乳腺肿瘤的发生和发展是一个复杂的多基因参与的生物学过程,每个阶段均由不同的基因和信号分子调控。近年来,以分子分析技术为基础的肿瘤分型系统的建立,为肿瘤的分类提供了更多的信息,50余种组织和细胞特异性的乳腺癌发病动物模型相继建立,肿瘤的早期检出率和治愈率不断提高,患者死亡率逐渐下降。乳腺肿瘤研究的动物模型多借助于转基因小鼠,主要研究策略是在组织特异性启动子的诱导下,通过SV40、Ras、Neu等原癌基因诱导小鼠发生乳腺癌,观察肿瘤的特征和性质,并研究相关基因的功能,但是建立在同源重组基础上的转基因动物并不能完全模拟人体内乳腺癌的发病环境和特点。在新型乳腺肿瘤发病模型的研究中,以RCAS逆转录病毒载体为基础的RCAS-TVA系统备受关注借助病毒侵染,诱导单个细胞突变,从而诱导肿瘤发生的方法逐渐被认可。Twist基因是存在于人类染色体上的重要转录因子,上世纪90年代的研究表明：Twist基因在胚胎发育过程中对于中胚层的形成具有重要作用。Twist基因与肿瘤转移的关系于2004年被首次报道,它可以通过促进上皮-间叶转化而促进肿瘤细胞的侵袭和转移,此外,Twist还与细胞周期及凋亡、血管形成和肿瘤细胞耐药性有关,但目前的研究大多集中在细胞生物学水平,随着Twist条件性敲除转基因小鼠的建立,Twist与肿瘤转移的关系越来越多的被关注。为克服传统转基因动物模型的弱点,真实模拟体内肿瘤的发生、发展和转移的生物学环境,并在动物体内深入研究肿瘤相关基因的功能,本文建立基于RCAS-TVA系统的小鼠乳腺癌发病模型,并以转录因子Twist为对象,研究该基因在肿瘤发生、发展和转移过程中的重要作用,主要研究内容和结果如下：(1)RCAS-CRE-IRES-PyMT逆转录病毒质粒载体的构建与病毒的制备设计CRE作用元件(Cre重组酶基因)和原癌基因PolyomavirusMiddleTAntigen(PyMT)两段基因插入序列,并以内部核糖体进入位点InternalRibosomalEntrySite(IRES)作为Linker连接,以逆转录病毒质粒载体RCAS-Y为基础,通过分子生物学手段,构建RCAS-CRE-IRES-PyMT重组子质粒载体。该重组子质粒载体的特点是：借助LongTerminalRepeat(LTR)启动子序列和内部核糖体进入位点IRES序列的共同作用,在同一条mRNA上分别同时表达CRE和PyMT两个基因,并以WesternBlot方法检测基因表达。结果表明：病毒载体可同时表达CRE和PyMT,且IRES序列前后,两种蛋白表达水平相当,确保了CRE和PyMT生物学功能的发挥；采用细胞转染和超速离心的方法收集RCAS-CRE-IRES-PyMT病毒,测定病毒滴度为1010/ml。(2)基于RCAS-TVA系统的小鼠乳腺癌发病模型的建立及性质通过MMTV-TVA转基因小鼠与Rosa26R-LacZ报告基因小鼠的杂交,在F2代获取Rosa26R-LacZR/+MMTV-TVA+/-小鼠,并以此为模型,借助乳腺导管原位注射的方式,诱发小鼠产生蓝色乳腺肿瘤,通过检测目的基因的特异性表达、肿瘤的发生和生长曲线、肿瘤发展各阶段的细胞表面标志物的变化,系统研究该动物模型的性质和特征。结果表明：建立在RCAS-TVA系统的理论基础上,逆转录病毒通过特异性的侵染乳腺组织管腔内皮细胞,在诱发小鼠乳腺肿瘤的同时,实现了目的基因的条件性敲除,为基因功能研究奠定了基础。实体瘤组织发生于病毒侵染后的第7-9周,并于第10周后出现侵袭和转移特性；该模型中肿瘤细胞的特征与传统转基因动物模型不同,更加真实的模拟了人体内肿瘤发生环境。(3)转录因子Twist在小鼠乳腺癌肺转移中的作用初步研究通过MMTV-TVA转基因小鼠与TwistF/F转基因小鼠的杂交,在F2代获取TwistF/F-MMTV-TVA+/-小鼠,并以此为模型,借助乳腺导管原位注射的方式,诱发小鼠产生乳腺肿瘤,通过检测肿瘤的发生、生长和转移,研究Twist基因与乳腺肿瘤的关系。结果表明：Twist基因对肿瘤的发生和生长没有影响,但是对肿瘤的转移具有促进作用；Twist可以通过调控EMT过程中相关标志物基因的变化而促进乳腺肿瘤的肺转移。本文通过建立基于RCAS-TVA系统的小鼠乳腺癌发病模型,并以转录因子Twist为对象,研究该基因在肿瘤转移中的功能,为乳腺肿瘤动物模型的建立和乳腺肿瘤转移的相关基因功能的研究提供了新思路。【关键词】：药物载体EPR效应顺铂聚谷氨酸裸鼠移植瘤模型肾脏毒性RCAS-TVA系统Cre-LoxP系统Rosa26R-LacZ转基因小鼠MMTV-TVA转基因小鼠Twist(F/F)转基因小鼠肿瘤转移【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：R-332;R737.9【目录】：第一部分中文摘要6-8第一部分英文摘要8-10第二部分中文摘要10-12第二部分英文摘要12-15第一部分15-93第一章文献综述15-361.导言152.铂类抗肿瘤药物研究进展15-213.高分子聚合物药物载体研究进展21-344.本文的研究目的和意义34-36第二章顺铂-聚谷氨酸聚合物的性质及其临床常用铂类抗肿瘤药物的比较研究36-631.材料,仪器及实验试剂36-382.实验方法38-433.实验结果43-604.讨论60-63第三章顺铂-聚谷氨酸天冬氨酸复合物的性质及抗肿瘤活性研究63-811.材料,仪器及实验试剂63-642.实验方法64-683.实验结果68-794.讨论79-81参考文献81-92创新与不足92-93第二部分93-177第一章文献综述93-1111.导言932.乳腺癌分子亚型及研究进展93-963.乳腺癌发病动物模型96-984.RCAS-TVA系统简介及技术原理98-1025.条件性基因敲除策略102-1066.转录因子Twist基因的研究进展106-1087.本文的研究思路及意义108-111第二