中华绒螯蟹表达序列标签(EST)分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究

中华绒螯蟹表达序列标签(EST )分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究【摘要】:中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis )是我国重要的养殖对象之一。 近年来，随着养殖规模的扩大和集约化程度的提高，细菌、病毒和类立克次体生物等引起的各种病害日益严重，给中华绒螯蟹养殖业带来了巨大损失。 现在病害仍然是困扰养殖业的重要因素。 除了改善环境因素外，提高机体自身免疫力和抗病力是解决这一难题的重要途径。 本文试图从分子角度研究中华绒的免疫防御机制，为此重要方法提供坚实的理论基础。 本研究利用分子生物学和生物信息学手段，首次完成了中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建和表达序列标签(EST )的分析，不仅丰富了中华绒螯蟹的基因数据，而且筛选了大量免疫相关基因序列。 在此基础上，通过cDNA末端快速扩增(RACE )和实时定量PCR技术分析主要免疫相关基因的克隆和表达模式，这些研究为了解中华绒螯蟹免疫机制提供了基础资料，同时为蟹病的防治提供了新的思路。 主要研究结果：1通常采用cDNA文库构建技术，从滴度4.50106CFU/mL、库容3.3106CFU/mL、重组率73%的成功构建中华绒螯蟹血细胞cDNA文库中随机选择3，118个克隆5末端单向性这些序列的平均长度为561bp。 在拼接之后，得到包括292个重复组(Contig )和757个单序列(Singleton )的1，049个unique序列。 根据GeneOntology功能分类，发现488个Unique序列被注释为已知的功能基因，551个Unique序列未被注释为任何功能，这是参与26个中华绒螯蟹的先天性免疫反应，例如酚氧化酶系统的丝心蛋白Kazal-型蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、-大球蛋白、酚氧化酶原活化因子及酚氧化酶原、发现了与凝聚反应有关谷胱甘肽转移酶的与抗氧化系统相关的超氧化物歧化酶， 谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽过氧化酶、抗菌肽类抗脂多糖因子、壳聚糖和Osmotin对分子类c型凝集素、甘露糖结合蛋白、脂多糖和- 1，3 -葡聚糖结合蛋白、Toll受体蛋白进行模式识别。 EST表达丰度分析表明，中华小檗碱血细胞的主要免疫相关基因是Kazal-型蛋白酶抑制剂和c型凝集素。 双模式识别蛋白及其功能的研究是目前甲壳动物免疫学的研究重点之一，许多模式识别蛋白及其功能已经明确。 本研究根据EST提供的信息，利用RACE技术成功克隆了中华小檗碱模式识别蛋白脂多糖和- 1，3 -葡聚糖结合蛋白(LGBP )基因的全长cDNA序列。 生物信息学分析表明，该序列全长为1，236 BP，26bp的5末端非转录区(5UTR )，1， 含有089bp开放阅读框(ORF )和121 BP 3末端非转录区(3UTR )编码362氨基酸，15氨基酸信号肽的蛋白质序列和中国明虾(Penaeuschinensis )，细角虾(litopenaeusis ) 所有凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei )与淡水小龙虾(Pacifaxtacusleniusculus)LGBP相似性分别为67%、66%、66%、61%； 该基因编码蛋白包括整合子结合区、激酶c磷酸化部位、n键糖基化部位等几个保守区域，还发现了水解酶部位。 实时定量PCR结果表明，LGBP基因mRNA在中华绒螯蟹肝胰腺、鳃、肌肉、血细胞、胃和肠中表达，其中在血细胞中的表达量最高。 嗜水菌急性感染实验结果表明，LGBP在血细胞中的表达量在感染后1.5h达到最高水平，与对照组比较差异有显着性(P0.05 )，随后呈下降趋势，感染后12h恢复到初始水平，说明该基因与中华绒螯蟹的抗病过程有关。 三酚氧化酶原活化酶(PPAF )的活化及PPAF活化酚氧化酶原是酚氧化酶系统行使非特异性免疫功能的重要步骤。本研究成功克隆了中华绒螯蟹PPAF基因全长cDNA序列。 该序列的全长为1,386bp，其中包括154 bp5UTR、1,134bporf和95bp 3UTR，编码378氨基酸。 该编码蛋白包括信号区、半胱氨酸折叠区和保守丝氨酸区。 当然了。 与其他无脊椎动物的PPAF氨基酸序列相比，PPAF氨基酸序列具有较高的相似性(55%-75% )。 PCR结果表明肝脏、肌肉、肠道、鳃中均有PPAF表达。 好氧菌急性感染后6h、12h、48h，与对照组相比，PPAF基因mRNA的表达水平显着增加(P0.05 )。 GPx基因cDNA全长为1,101bp，其中包括94bp 5UTR、660bpORF和347 bp3UTR。 该ORF编码219个氨基酸，无信号肽序列。 ORF中没有发现编码硒代半胱氨酸的序列(TGA )，这表明GPx是不含Se的GPx。 该序列包括典型的过氧化物区、烷基过氧化还原蛋白(AhpC )区和硫氧还原蛋白折叠区。 序列比较表明，该基因的氨基酸序列与锯屑蟹(scular )、地中海海绵(Suberitesdomuncula )和繁膜海绵(Hymeniacidonperlevis)GPx氨基酸序列相似性分别为81%、67%、66%。 GPx基因mRNA在各组织中表达，其中肝胰腺表达量最高，血细胞表达量较低。 结果表明，中华绒螯蟹的GPx基因主要表达于肝胰腺。 好氧菌感染中华绒螯蟹后，GPx基因mRNA在血细胞中的表达显示出降低作用。 感染后1.5h，GPx基因mRNA表达量显着低于对照组(P0.05 )，随着感染时间的延长，感染组GPx基因mRNA表达量提高，但仍显着低于对照组。 结果表明病原菌感染可能抑制中华绒螯蟹GPx的表达。 GST基因cDNA全长958bp，包括85bp 5UTR、651bpORF和222 bp3UTR。 ORF编码216个氨基酸，其中含有17个氨基酸组成的信号肽。 序列比较表明，该蛋白质氨基酸序列与赤拟谷盗(Triboliumcastaneum )和倦库纹(Culexquinquefasciatus)GST的相似性为53%，大山雀(Anophelesdirus )和库蟹(culicoidesvariipt ) 该蛋白质氨基酸序列包括由82个氨基酸组成的g位点和由126个氨基酸组成的h位点，还包括与蛋白酶氧化位点N-结合的糖基化位点。 相似性和系统分析表明，该GST属于delta-GST。 实时定量PCR分析表明，中华绒螯蟹GST在肝胰腺、肌肉和血细胞中均有表达，但鳃、胃和肠均未检测到表达。 其中血细胞中表达量最高，说明血细胞是其主要合成部位。中华绒螯蟹感染嗜水气单胞菌后，GST在血细胞中的表达量在感染后6h达到最大，与对照组有显着差异(P0.05 )，随后呈下降趋势，感染后12h恢复至起始水平。 结果表明，GST基因不仅在解毒方面起着重要作用，还参与了中华绒螯蟹的免疫反应。 【关键词】:中华绒螯蟹血细胞表达序列标签免疫相关基因脂多糖-13-葡聚糖结合蛋白(LGBP )酚氧化酶原激活酶(PPAF )超氧化物歧化酶(SOD )谷胱甘肽过氧化物酶(GPx )谷胱甘肽- s【学位授予机构】:华东师范大学【学位级别】:博士【学位授予年】: 2009【分类编号】: S917.4【目录】:中文摘要6-10ABSTRACT10-15第1章文献综述15-40第1节表达序列标签(EST )的研究进展和甲壳动物的EST15-21第2节甲壳动物先天性免疫系统的研究进展21-34第3节中华绒螯蟹免疫基因研究概况34-39第4节本论文的研究目的， 意义和技术路线39-40第二章中华小檗碱血细胞cDNA文库的构建和EST分析40-63第一节中华小檗碱血细胞cDNA文库的构建40-47第二节中华小檗碱血细胞cDNA文库的EST分析47-63第三章中华小檗碱脂多糖和-1 3-葡聚糖结合蛋白p )基因克隆和表达63-86第1节中华小檗碱LGBP基因全长cDNA的克隆和序列分析63-79第2节水分好氧单细胞菌急性感染对中华小檗碱LGBP基因mRNA表达的影响79-86第4章中华小檗碱氧化酶激活酶(PPAF )。 基因克隆和表达86-102第1节中华绒螯蟹PPPAF基因全长cDNA的克隆和序列分析