分子生物学复习题(郭洁)

2013年分子生物学（分子遗传学）硕士生复习题1 阐述你对基因概念的理解和诠释。基因是编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列（对以RNA作为遗传信息载体的病毒而言则是），包活编码序列（外显子）、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列（内含子）。基因是生物体传递和表达遗传信息的基本单位，基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。）染色体水平上的基因概念：孟德尔的豌豆杂交试验总结出生物的遗传性状是由遗传因子控制的，肯定遗传的物质性。基因一词由丹麦生物学家约翰逊提出。著名遗传学家摩尔根对基因做出定义：基因在染色体上呈直线排列，基因是遗传物质的基因单位和突变单位，基因是控制性状的功能单位，它能产生对立的表现型，这意味基因是染色体上的一个特定区域。）代谢水平上的基因概念：比德尔和塔特姆提出“一个基因一个酶”学说，只适用于同源多聚体构成的酶类。本柔进行了经典的基因精细结构分析，将比德尔提出的学说发展为“一个基因一条多肽链”的概念，把遗传功能单位称为顺反子。3）DNA分子水平的基因概念：Avery的细菌转化实验中指出：携带遗传信息的是DNA而非蛋白质，Hershey和Chase对T4噬菌体感染大肠杆菌证实遗传的分子基础是核酸，Waltson和Crick提出DNA双螺旋结构模型，从分子水平揭示了基因的结构。Blake进一步提出可能每一个外显子相当于蛋白质的一个结构单位，“一个外显子，一个结构域”的精细表达。分子生物学的发展进一步扩展了基因的概念，证明了基因不仅可以重叠，而且可被分离，有的基因并不被转录或不完全转录，而作为一个单位转录的也往往不是一个基因。以前认为基因是在染色体上成直线排列的独立单元，现已发现一些相关的基因在染色体上的排列并不是随意的，而是由相关功能的基因构成一个小的“家族”或基因群。随分子水平上基因结构与功能的研究，发现了移动基因、断裂基因、假基因、重叠基因等。DNA分子上有遗传效应的节段可以分两类：一类能转录，产生RNA分子，称为转录基因；另一类不能转录，但对转录能起调节控制作用，称为操纵基因。转录基因有mRNA基因、tRNA基因、rRNA基因和调节基因。其中mRNA基因通过转录和翻译，能产生对应的蛋白质，这种蛋白是细胞中重要的结构和功能物质，mRNA基因称为结构基因。调节基因通过转录和翻译也能产生对应蛋白，对转录基因有调节作用。tRNA基因、rRNA基因能转录，但不能翻译成对应的蛋白，只能在合成蛋白的过程中发挥特定作用，如果没有tRNA基因、rRNA基因，蛋白质的合成是不能进行的。启动基因是RNA转录酶识别盒结合的序列，操纵基因是阻遏蛋白结合的序列，他们虽不能转录、翻译成多肽，但这两种特定的核苷酸序列发生改变，就会改变相应结构极影的活性，就此意义上讲，他们也具有特定的遗传效应，所以也称为基因。2 举例解释蛋白质二级结构、超二级结构（MOTIF）、三级结构、DOMAIN和四级结构。蛋白质二级结构（secondary structure of protein）指它的多肽链中有规则重复的构象，限于主链原子的局部空间排列，不包括与肽链其他区段的相互关系及侧链构象。二级结构主要有-螺旋、-折叠、-转角。常见的二级结构有-螺旋和-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的，氢键是稳定二级结构的主要作用力。-螺旋(-helix)：蛋白质中常见的一种二级结构，肽链主链绕假想的中心轴盘绕成螺旋状，一般都是右手螺旋结构，螺旋是靠链内氢键维持的。每个氨基酸残基（第n个）的羰基氧与多肽链C端方向的第4个残基（第n+4个）的酰胺氮形成氢键。在典型的右手-螺旋结构中，螺距为0.54nm，每一圈含有3.6个氨基酸残基，每个残基沿着螺旋的长轴上升0.15nm。螺旋的半径为0.23nm。-折叠(-sheet)是蛋白质中的常见的二级结构，是由伸展的多肽链组成的。折叠片的构象是通过一个肽键的羰基氧和位于同一个肽链或相邻肽链的另一个酰胺氢之间形成的氢键维持的。氢键几乎都垂直伸展的肽链，这些肽链可以是平行排列（走向都是由N到C方向）；或者是反平行排列（肽链反向排列）。超二级结构也称之基元（motif）。是指在球状蛋白质分子的一级结构的基础上，相邻的二级结构单位（螺旋折叠等）在三维折叠中相互靠近，彼此作用，在局部形成规则的二级结构组合体，这种组合体就是超二级结构。组合形式：若干二级结构可以特殊的几何组合出现在蛋白质结构中，这些组合起来的结构单元称作超二级结构或花样。超二级结构可与某些特殊的生物功能相联系，也可仅作为结构的组装块。-环-花样是含有两个-螺旋，并以一个环区域相连接的具有特殊功能的超二级结构。在已知的蛋白质结构中观察到两种这样的花样，一种是 DNA结合花样，另一种是钙结合花样又称EF手，每种都有自己的几何形状和所需的氨基酸残基序列。EF手出现在来自肌肉的蛋白Parvalbumin，troponin以及calmodulin等结构中，它们通过结合钙来调节细胞功能的变化。EF手提供了一个维持钙配基的支架用于结合和释放钙，这是人们在蛋白质结构中首先认识的功能花样之一。组合形式：发夹或-环-花样是两条反平行的-链，通过一个环相连接构成的超二级结构，在蛋白质结构中频繁出现。-回折中相邻近的两条链易形成这种发夹 花样。两条链之间的环的长度不等，一般为2-5个残基。与-环-花样不同的是，发夹花样无特殊的功能。蛋白质的三级结构是指球状蛋白质的多肽链在二级结构的基础上相互配置而形成特定的构象。螺旋、折叠、转角和无规则卷曲等二级结构通过侧链基团的相互作用进一步卷曲、折叠，借助次级键的维系形成三级结构，三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布，它是建立在二级结构、超二级结构和结构域基础上的球状蛋白质的高级空间结构。1.含多种二级结构单元；2.有明显的折叠层次；3.为紧密的球状或椭球状实体；4.分子表面有一空穴（活性部位）；5.疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面；在蛋白质三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是几个超二级结构单元的组合。结构域：指蛋白质多肽链在二级结构的基础上进一步卷曲折叠成几个相对独立的近似球形的组装体。结构域（Structural Domain）是介于二级和三级结构之间的另一种结构层次。所谓结构域是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域，又称为辖区。多肽链首先是在某些区域相邻的氨基酸残基形成有规则的二级结构，然后，又由相邻的二级结构片段集装在一起形成超二级结构，在此基础上多肽链折叠成近似于球状的三级结构。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或多个在空间上可明显区分的、相对独立的区域性结构缔合而成三级结构，这种相对独立的区域性结构就称为结构域。对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和它的三级结构往往是一个意思，也就是说这些蛋白质或亚基是单结构域。结构域自身是紧密装配的，但结构域与结构域之间关系松懈。大分子蛋白质常由多条多肽链所组成，每条多肽链各具独立的三级结构。蛋白质的四级结构是指几个各具独立三级结构之多肽链的相互结集、以特定的方式接触、排列形成更高层次的大分子蛋白质的空间构象。在蛋白质四级结构中，每个各具独立三级结构的多肽链称为亚基。组成蛋白质的亚基数多为偶数，可以是同种或不同种的亚基，不同种的亚基一般都用、命名，酶调节与催化亚基多用R、C表示。在具有四级结构蛋白质分子中，亚基单独存在不具有生物活性，但并不是所有蛋白质分子都具有四级结构的，大多数蛋白质只具三级结构已有生物活性，只有分子更大的蛋白质才具有四级结构。3 在结构的组织层次上高于二级结构，但没有形成完整的结构域。简述Proteasomes结构与功能。蛋白质泛素依赖特异性降解的场所26S蛋白酶体。蛋白酶体广泛分布于真核生物的细胞核和细胞质，负责细胞内绝大多数蛋白的降解，他是一种巨大的依赖于泛素的具有多种蛋白水解酶活性的复合蛋白酶。蛋白酶体由几十个亚基组成，蛋白水解活性封闭在一个筒形的空腔中，同时阻止正常折叠的蛋白进入降解腔。26S蛋白酶体由20S核心复合物和19S调节复合物组成。20S核心颗粒是一种不依赖ATP和泛素的蛋白酶，由4个同轴的7亚基组成的七聚体环垒叠形成开口的筒状中空结构，切割蛋白的活性位点位于腔内，即蛋白水解室。核心颗粒两端各连接一个19S调节颗粒，这含有多个ATP酶活性位点和泛素结合位点。该颗粒作用是识别多聚泛素化降解信号，介导底物的去折叠反应，并使待降解底物进入20S水解腔内被降解为小肽。20S筒状核心颗粒由4个环状结构的垛叠成具有两端开口的筒状中空结构，中部2个环状结构分别由7种亚基组成，上下两端环状结构由7种a亚基组成。位于筒状外侧的a环作用：控制底物的进入和降解产物的释放，防止细胞内非降解蛋白误入降解腔，容纳相当数量的待降解底物和部分降解产物，介导19S调节复合物与核心复合物的结合。19S调节颗粒由17个不同亚基组成分为基底复合物和盖复合物两部分。基底由9个亚基组成，与20S蛋白酶体的a环相连，由6个具有ATP酶活性的亚基（RPT）和4个非ATP酶活性亚基（RPN）组成。在蛋白降解过程中，RPT亚基在ATP水解产生能量的条件下开启20S核心复合物降解腔，帮助降解底物的去折叠以及降解底物和产物进出降解腔。4个RPN亚基可能具有与不同底物蛋白结合的位点，使底物蛋白和26S蛋白酶体结合。4 简述泛素化蛋白降解途径。泛素蛋白酶体途径依赖于ATP和泛素，能高度选择性地进行细胞内胞质和胞核蛋白质的降解。这一通路包活泛素、泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、去泛素化酶（DUB）和蛋白酶体（Proteasomes），这条通路包活5步：1）泛素激活酶（E1）在ATP存在的条件下，催化游离泛素活化，形成过渡复合物泛素AMP，然后，E1以硫羟酸酯键与泛素的C端结合，形成泛素E1复合物。2)泛素结合酶（E2）取代泛素E1复合物中的E1，形成泛素E2复合物，E1离开泛素。3）泛素连接酶（E3）与E2协同作用，将泛素的C末端羧基与底物蛋白的赖氨酸残基以共价键结合，使底物蛋白连上一个泛素标记；随后，底物蛋白泛素链的LYS残基在E3的催化下与泛素E2复合物作用，再连接一个泛素，该过程重复多次，从而使靶蛋白多聚泛素化。4）多聚泛素化的蛋白被蛋白酶体识别并降解成短的小肽。5）同时在去泛素化酶（DUB）的催化下，泛素链从底物蛋白上脱落，分解成单个游离的泛素。游离的泛素在参与其他底物蛋白的泛素化过程。5 何谓Long Interspersed Nuclear Elements，你认为该序列的进化起源是什么？答：散在重复序列：散在方式分布于基因组内的重复序列。这类DNA序列一般都是中度重复序列。根据重复序列的长度可以分为4类：长散在重复序列(LINE)、短分散重复序列(SINE)、长末端重复序列、DNA转座子。Long interspersed nuclear elements:目的基因组测序发现,在哺乳动物的基因组中,单拷贝基因内和基因之间散布着大量的转座子,这些转座子曾经被认为是无用的“垃圾序列”。这些转座子中最有代表性的就是LINE-1(long interspersed nuclear elements 1,长散布重复序列1,简称L1)。L1是人类基因组中含量最多的自主性逆转录转座子,约占人类基因组DNA的17%。哺乳动物基因组中约1/3的成分都直接或间接跟L1逆转录转座有关。L1有2个开放读码框(opened reading frame),编码2种蛋白质:ORF1编码的蛋白有RNA结合活性,ORF2编码的蛋白有核酸内切酶和逆转录酶两种活性,2种蛋白都是L1转座所必需的。迄今为止已发现L1与多种生物学现象关联,包括基因突变, X染色体失活,基因重排,基因表达沉默,肿瘤发生,生物进化等。在机体免疫系统中,T细胞和B细胞抗原受体等位基因排斥,IL-2、IL-4的基因表达都与L1有关。 最近,已有研究表明:L1序列能够下调基因的表达Han将L1/2的ORF2(L1重复序列的一部分)和LacZ分别插入到GFP报告基因下游。与插入LacZ的序列比较,。LINE是可以自主转座的一类反转录转座子，来源于RNA聚合酶的转录产物。L1是LINE中的一种重复序列，长约6 500bp，哺乳动物基因组中的拷贝数可多达10万份，主要集中在AT富集区。从LINE的结构分析，它并不具有反转录病毒特有的LTR，因此曾把LINE归于非病毒超家族。测序的结果发现LINE L1的一个可读框同反转录酶是同源的，这提示LINE可能来源于能够编码转座所需的酶进行自主转座的可动元件，所以现在在分类时被归为人病毒超家族。L1插入片段的全长原初元件可能是哺乳动物中有活性的反转录转座子的来源。L1被认为是人类基因组中主要的可动因子，它不仅能自主转座，而且它的蛋白质产物可促使非自主转座因子的反转录转座。6 简述大肠杆菌DNA聚合酶III各亚基的功能。答：DNA聚合酶是在大肠杆菌中主要的复制聚合酶。DNA pol 是一种多亚基的蛋白。在DNA新链的从头合成（de novo）中起复制酶的作用。DNA聚合酶主要由2个部分组成：核心酶和全酶DNA聚合酶III是多亚基组成的蛋白质,它在细胞中含量很少,在每个细胞中只有1020个拷贝的全酶，Pol III全酶由,10种不同的亚基组成核心酶主要负责基本的酶活性，由, ，组成。亚基由polC 基因编码，具有53方向合成DNA的催化活性,每秒可以合成8个核苷酸，但不具有校正功能。亚基由dnaQ基因编码，具有35外切核酸酶的校对功能,在体内其基本功能是控制复制的忠实性,亚基常与亚基形成一个紧密的1:l复合物,协同发挥功能.亚基由holE基因编码，使核心酶相互连接全酶是dna聚合酶iii中功能部分，包含所有必要的行使酶功能的亚基。亚基使核心酶形成二聚体，与模板连接，具有ATP活性。亚基是以二聚体的形式存在的.在复制过程中二聚体环绕着DNA,并能在DNA上自由滑动,构成一个滑动钳.滑动钳可把全酶束缚在模板DNA上,从而保证高度的进行性和聚合反应速度。复合物是滑动钳的载体,可帮助滑动钳结合到DNA上. 复合物含有5个不同的亚基,形成一种化学计量为21111的结构. 二聚体自己并不能组装到DNA 上 ,它是通过复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的.7 阐明端粒结构与端粒酶的功能。答：端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，是由端粒DNA和与端粒DNA特异结合的端粒结合蛋白组成的核糖核酸的蛋白质复合物，DNA 由简单的串联重复序列组成.它的合成由一个特殊的具有反转录活性的核糖核蛋白端粒酶完成.端粒对染色体、整个生物基因组,甚至对细胞的稳定都具有重要意义.在真核生物包括原虫、真菌、纤毛虫、植物和哺乳动物中都存在。端粒 DNA 由非编码的重复序列组成，不同物种的DNA 重复序列的重复数不同，如人与其他脊椎动物约为2 000 个，例如在人中，端粒的重复系列是TTAGGG，而在纤毛虫中是TTGGGG。端粒高度的保守性表明端粒具有非常重要的作用其主要功能包括：(1) 保护染色体末端25真核生物的端粒DNA 如帽子一般保护染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解，同时可能还有防止端粒酶对端粒进行进一步延伸的作用改变端粒酶的模板序列将导致端粒的改变，从而诱导细胞衰老和死亡(2) 解决染色体复制时末端丢失问题细胞分裂、染色体进行半保留复制时存在染色体末端丢失的问题随着细胞的不断分裂，DNA 丢失过多，将导致染色体断端彼此发生融合，形成双中心染色体、环状染色体或其他不稳定形式端粒的存在可以起到缓冲保护的作用，从而防止染色体在复制过程中发生丢失或形成不稳定结构(3) 细胞的“生命钟”染色体复制的上述特点决定了细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”(4) 固定作用染色体的末端位于细胞核边缘，人类端粒DNA 和核基质中的蛋白相互；作用，以TTAGGG 结构附着于细胞核基质补充（只做了解）端粒的复制：细胞有丝分裂需要染色体的复制，按照经典的复制模式，染色体DNA 双链不能完全复制后续链上的最后几个核苷酸，造成子代细胞中DNA 双链的其中一条链(5端)缩短而另一条链(3端)形成富G 的突出链所以每次细胞分裂就会造成端粒相应地缩短，这就是所谓的“末端复制问题”真核生物依靠端粒酶解决染色体的末端复制问题端粒酶发挥作用时，它直接作用于端粒的领先链进行阵发式的延伸，而端粒的滞后链是由DNA 聚合酶按照常规的方式合成的，且端粒领先链与滞后链的合成紧密相关事实上，当滞后链的聚合酶出现某些缺陷时，端粒酶也不再介导领先链的合成如果滞后链不伴随领先链的合成而延长的话，端粒酶将在染色体的末端产生一段很长的单链片段，这种单链片段不仅容易引起染色体的高度重组，而且极容易被视作DNA 损伤的信号引起细胞周期检测点的抑制因此，领先链和滞后链的相伴而行对提高基因组的稳定性具有极其重要的意义端粒酶是一种能将真核生物染色体末端DNA端粒DNA 加以延伸的酶它是一种核酸蛋白质复合物目前认为端粒酶是由端粒酶RNA 组分(telomerase RNA，TR)，端粒酶相关蛋白和端粒酶催化亚基(telomerase reverse transcriptase，TERT)三部分组成的蛋白质复合物。它解决染色体的末端问题,归属于逆转录酶家族又和逆转录酶有一定的差别.端粒酶的过度表达和细胞的永生化和癌变直接相关.端粒酶的结构和功能决定了它在肿瘤与癌症治疗等方面具有广泛的应用前景.端粒酶结构中的核酸部分为RNA，又分为模板区与非模板区模板区决定所合成端粒的特异性，非模板区具有酶与底物的结合位点模板区的长度一般为端粒重复序列长度的11.5 倍不同物种端粒酶RNA 部分的核苷酸组成存在差异端粒酶以RNA 为模板催化合成DNA。端粒酶的主要作用是维持端粒的长度端粒酶不但可以维持已经存在的端粒DNA，同时端粒酶反转录酶能够识别断裂染色体的末端，重新将端粒重复序列加到染色体的断裂末端或非端粒DNA上端粒酶能利用端粒3端单链为引物，自身的RNA 为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度人的生殖细胞、造血干细胞及T，B 淋巴细胞中端粒酶有不同程度的表达，而在正常的体细胞中，端粒酶处于失活状态，因此体细胞随细胞分裂次数的增加端粒逐渐缩短端粒的长度与有丝分裂次数相关，所以端粒又有细胞的“有丝分裂钟”之称8 概述引起倾向性突变的修复系统。答：SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-prone repair），使细胞有较高的突变率。SOS修复的定义（补充，可看可不看）一种能够引起误差修复的紧急呼救修复，是在无模板DNA 情况下合成酶的诱导修复。正常情况下无活性有关酶系，DNA受损伤而复制又受到抑制情况下发出信号，激活有关酶系，对DNA损伤进行修复，其中DNA多聚酶起重要作用，在无模板情况下，进行DNA修复再合成，并将DNA片段插入受损DNA空隙处。SOS是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能，它主要包括两个方面：DNA修复和导致变异。在一般环境中突变常是不利的，可是在DNA受到损伤和复制被抑制的特殊条件下生物发生突变将有利于它的生存。碱基出现错配时，DNA聚合酶就会在原地打转而不前进，或脱落下来使DNA复制合成中止，SOS就会诱导产生DNA聚合酶和，它们不具有3-5核酸外切酶校正功能，于是在DNA链的损伤部位即使出现不配对碱基，复制仍能继续前进。在此情况下允许错配增加存活的机会。在正常情况下，修复蛋白的合成 是处于低水平状态的，这是由于它们的mRNA合成受到阻遏蛋白LexA的抑制。细胞中的recA 蛋白也参与了SOS修复。当DNA两条链的都有损伤并且损伤位点邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在Restriction Endoneuclease和Exoneuclease的作用下造成损伤处的DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，仍然终于保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。9 阐述原核生物DNA修复的BER, NER, DNA-Mismatch repair system, NHEJ, SOS Repair, TLR机制。10 什么是silent mutations？你认为是否一定对生物功能无影响，为什么？11 阐述DNA重组HOLLIIDAY模型中蛋白的作用。12 阐述易位因子概念和易位机制。13 原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么？如何分析大肠杆菌启动子保守序列的重要性？14 RNA聚合酶I识别的启动子包含有哪两个部分？分别由什么蛋白因子识别？15 RNA聚合酶III识别的启动子有哪几类？其定位因子是什么？16 列出你所知的RNA聚合酶II识别的启动子顺式作用因子。17 从“Mix and match”的观点来讨论真核生物RNA聚合酶II启动子元件与功能的关系。18 从“COMBINATORIAL CONTROL”的观点来讨论多蛋白作用于真核生物转录的作用。19 请阐述RNA EDITING和RNA HOMING 概念。20 请阐述RNA剪切中具有催化功能的RNA分子（核酶）的作用及应用的研究进展。21 请阐述核内RNA剪切与其它RNA分子成熟机制之间的关系。22 Alternative Splicing的类型，功能和机制举例。23 tRNA氨酰合成酶以怎样的方式保证正确的tRNA-RR的合成。24 讨论原核生物和真核生物在蛋白质合成起始机制的异同。答：原核和真核在蛋白合成起始机制主要的不同在于，起始因子：起始因子是一类协助形成蛋白质合成起始复合物的蛋白质因子，时至目前已知原核由3种（IF-1,IF-2,IF-3）,真核有13种原核翻译的机理三个阶段：起始，延伸，终止，以E.coli为例肽链的合成肽链合成的起始设计在mRNA上阅读框架处一个起始复合物的组装。由核糖体亚基、一个mRNA模板、一个起始的tRNA分子和起始因子组成并组装在蛋白质合成起始点的复合物。起始阶段的部分作用是确保在翻译开始前确定合适的起始密码字和正确的阅读框架。1. 三元复合物的形成：核糖体小亚基附着于mRNA的起始信号部位，该结合反应是有起始因子3（if-3）介导的，另有Mg2+的参与，最终形成IF-3-30SmRNA三元复合物。2. 30S前起始复合物的形成 在起始因子的作用下，甲酰甲硫氨酸起始型tRNA（fMet-tRNAMet）与mRNA分子中起始密码字（AUG或GUG）接合，即密码子与反密码子相互反应。同时IF-3从三元复合物上脱离开来，形成30S前起始复合物（30Spreinitiation comlex），IF-2-30S-mRNA-fMET-tRNAMet复合物，该步亦需GTP和Mg2+的参与3. 70S起始复合物的形成：50S亚基与上述的30S前起始复合物结合，同时IF-2因子脱离，形成70S起始复合物，即30smRNA50sfMet-tRNAMet复合物，此时fMet-tRNAMet占据50S亚基的肽酰位，而该亚基的氨基酰位暂为空位。简述：initiation（起始）：E.coli翻译过程的起始是翻译起始复合物的生成，其具体分五步： IF3、IF1使核蛋白体大、小亚基分离并协助小亚基与mRNA的SD序列结合，IF1占据A位； fMettRNAMetIF2GTP复合物辨认并结合于mRNA起始密码子AUG上； fMetRNAMet定位于P位，A位空出； 大、小亚基结合； IF2结合的GTP水解释能,IF1、IF2、IF3脱落，形成70S翻译起始复合物。原核mRNA有两个起始识别位点：（AGGAGG）SD序列 起始密码子AUG在一条mRNA上可能会有很多AUG，能作为起始密码子的AUG由SD序列来标明。核糖体30S亚基中的16SrRNA通过与SD序列发生直接的碱基配对而识别这一序列。真核生物蛋白质生物合成机制：真核生物蛋白质合成过程基本类似于原核生物。其区别在于除参与蛋白质生物合成的核糖体结构，大小，组成及mRNA结构等不同外，在蛋白质生物合成的起始步骤中所涉及的起始因子较多，起始过程复杂，表现为：l 特异性tRNA为Met-tRNAMet，不需N末端的甲酰化l Met-tRNAMet和GTP,eIF-2直接形成一个可分离的不依赖于小亚基的复合物，而原核生物IF-2与tRNAMet是结合于30S的小亚基上l tRNAMet与40S小亚基的结合前与mRNA结合。相反，在原核生物中是tRNAMet与30S 小亚基结合后在与mRNA结合。l mRNA结合到tRNAMet40S小亚基复合物上时，由ATP水解提供能量l 真核生物中，eIF不仅种类多，且是多亚基蛋白质，最突出的是因涉及mRNA的结合,eIF-3类似于原核生物IF-3的作用，含有近10个亚基，相当于40S亚基重量的1/3.l 对于mRNA参与起始复合物的形成，为避免来自核酶的降解需在mRNA 的5端加上帽子结构真核翻译起始的扫描模型：1.40S小亚基识别mRNA 5帽子并与它结合2.40S小亚基延mRNA 5到3方向扫描3.当40S小亚基移动到AUG起始密码子处，扫描停止4.60S大亚基在蛋白因子的作用下，与40S小亚基形成80S核糖体，开始翻译25 讨论实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达的分子元件。全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架、基因克隆表达系统成熟完善、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定、被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。缺乏对真核生物蛋白质的复性功能、缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白、真核与原核生物结构上存在差别。提高外源基因表达效率的方法：1. 选择强启动子序列，如tac（trp-lac）等。启动子的-10区序列、-35区序列以及这两个序列的距离对启动子的强弱有关。2. 调整S-D序列与AUG碱的距离 一般为5-9bp 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。3. 改变起始密码下面的几组密码子，能提高翻译的起始效率。4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性。5. 减轻宿主细胞的代谢负荷：合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系 （1）诱导表达：将宿主生长代谢与外源基因表达分开，一般采用温度诱导或药物诱导，PL启动子是温度诱导型。（1）诱导表达：tac启动子是药物诱导型，调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。无IPTG ：阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。有IPTG ：阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。（2）表达载体诱导复制：将宿主的生长与载体的复制分开。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。6. 提高表达产物的稳定性：防止被宿主的酶降解。 （1）设计成融合蛋白：这是避免被降解的最好措施。N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解，减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。1)使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。2)大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。3)T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。（3）表达分泌蛋白，细菌蛋白分泌的条件：有信号肽:位于N端，一般为15-30aa 。真核与原核的结构相似, 功能相似，可以互换。细胞内的转运机制:信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30%。减少形成包涵体的策略：降低重组菌的生长温度、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂（高浓度多醇类、蔗糖）、供给丰富的培养基，创造最佳培养基（供氧、pH等）26 解释小分子效应物在原核生物中基因表达调控的作用和机制。原核生物的操纵子通过调节蛋白与小分子物质相互作用达到诱导状态或阻遏状态，这些小分子是代谢途径的底物或产物，属于基因表达的调节物质，成为效应物。1）诱导物：在自然状态下有些阻遏蛋白一般结合在DNA分子上，无诱导物存在时，阻遏蛋白与操作基因牢固结合，阻止RNA聚合酶进入启动子区域，操纵子被关闭，结构基因不能转录。当诱导物存在时，诱导物与阻遏蛋白结合，促使后者空间构象变化，使阻遏蛋白与操纵基因亲和力下降而解离下来，RNA聚合酶能进入启动子区域，开启了结构基因的转录表达。最典型例子是大肠杆菌的乳糖操纵子。因诱导物存在是基因表达开放的调节称为可诱导的调节，某些基因在诱导物作用由原来的关闭状态转变为开放状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。2）辅阻遏物：有些阻遏蛋白本身不具有结合操纵基因的活性，在自然状态下操纵子是开放的，能正常表达。当细胞中有辅阻遏物存在时，它可以结合到阻遏蛋白分子上，提高阻遏蛋白与操纵基因的亲和力。这与诱导物的作用相反。例如：大肠杆菌的色氨酸操纵子中，色氨酸与其操纵子中的阻遏蛋白结合，使后者表现出结合操纵基因的活性，阻止了RNA聚合酶与trp操纵子上启动子的结合，使操纵子关闭，有关色氨酸合成的酶基因不能被转录。由辅阻遏物参与引起的调节称为可阻遏的调节。这类基因在正常情况下都是开启的，处于在合成蛋白或酶的状态下，由于一些特殊代谢终产物或化合物的积累将其关闭，阻遏了基因的表达，所以称为可阻遏基因。综上所述，可诱导的操纵子是一些编码糖和氨基酸分解代谢的酶和蛋白的基因，这些物质平时含量很少，因为细菌总是利用最容易利用的能源物质（如葡萄糖分解）来提供能量，所以这些操纵子常常关闭，但当生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用乳糖时，这些基因被诱导表达。可诱导的基因情况相反，它们是一些合成各种细胞代谢过程中所需的重要物质（氨基酸、核苷酸）的基因，由于这些物质在生命活动过程中的重要地位，编码这些基因的操纵子在正常情况下总是开放的。当这些物质在细菌生活环境中含量较高时，该操纵子就自然被关闭，停止合成。27 举例介绍真核生物在不同水平上实现蛋白基因调控表达的机制。DNA水平上的基因表达调控：1）基因扩增：某个或某些基因的拷贝数选择性增加的现象。基因扩增使细胞在短期内产生大量专一基因产物以满足生发发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾卵母细胞通过形成几千个核使rRNA拷贝数扩增4000多倍。2）基因重排：将一个基因从远离启动子的地方移到距离启动子很近的位点从而启动转录。典型例子是免疫球蛋白结构基因和T细胞受体基因的表达，前者由B淋巴细胞合成，后者由T淋巴细胞合成。3）基因丢失：指有些低等真核生物的个体发育过程中，在细胞分化时一些不需要的基因被消除的现象。4）DNA修饰：甲基化，能引起染色质结构、DNA结构、DNA稳定性的改变，如雌性哺乳动物细胞有两个X染色体，其中一个高度异染色质化而永久失去活性，非活性区域甲基化程度高，活性区很少甲基化。转录水平上：1）活化基因：真核生物RNA聚合酶自身对启动子并无特殊亲和力，单独不能进行转录。真核RNA聚合酶不能单独识别、结合启动子，而是先由基本转录因子TFD组成成分TBP识别TATA盒或启动元件，并有TFA参与结合，形成TFD-启动子复合物，继而在其他转录因子参与下，RNA聚合酶与TFD、TFB聚合，形成功能性前起始复合物。2）启动子和增强子的顺时作用元件：真核细胞启动子由一些分散的保守序列所组成，包活TAT