第八章-组织工程与生物材料

第八章组织工程与生物材料,主要内容,概述细胞培养支架设计及制备技术生物微胶囊,8.1概述组织工程学：应用工程学和生命科学的原理与方法,研究和开发具有生物活性的人工替代物，达到修复、维持或改善损伤组织功能的一门科学。（Langer和Vacantil，1993年，）,基本概念,基本方法：将在体外培养、扩增的功能相关的活细胞种植于多孔支架上,细胞在支架上增殖、分化,构建生物替代物,然后将之移植到组织病损部位,种植的细胞在生物支架逐步降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。,核心：建立由细胞和生物材料构成的三维复合体,三要素：种子细胞、信号因子(细胞因子或生长因子)和支架材料,1.特定组织的细胞特定组织的细胞是指从供体组织的健康部位收集个体细胞，分离后，再移植到患者所需要的部位。细胞移植与整个器官移植相比具有明显的优势：仅仅需要很少量的供体细胞就可进行移植；活的供体不必牺牲整个器官；分离细胞的用处可以排除易发生免疫反应的细胞类型；最后，整个费用也得到了降低。,2.细胞生长因子在组织器官的再造中，各类组织诱导因子、生长因子和血管形成刺激因子将有利于组织的形成。例如，促进骨细胞的分化与再生的是一些蛋白质生长因子，其中起主要作用的是骨形态发生蛋白(BMP)。这种活性蛋白质可诱导血管周围游动间充质细胞转转化为不可逆性骨系细胞,如何将生长因子与载体组合成生长因子的释放系统，是组织工程中有效利用生长因子的关键。,3.组织工程支架材料（细胞载体材料）分离的细胞自身不可能形成组织，它们需要特殊的环境，通常包括细胞生长临时的支架材料。这种三维支架材料常常模拟其自然对应物一体内的细胞外基质(ECM)，它们既起物理支架的作用，又是实质细胞在体外培养和后期植入的粘附物质。,细胞载体材料是利用组织工程技术再造人类器官的物质基础，是组织工程技术中研究的关键。,8.2细胞培养,细胞培养是指从体内取出的细胞或组织在模拟体内生理环境，于无菌、合适温度和一定营养条件下在体外培养，使其生存、生长、增殖，并保持其结构和功能的方法。它包括从活体中取出的细胞或已建立的细胞系在体外培养生长、增强，但不再分化为组织。,一、细胞培养的基本条件(一)无污染环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。(二)基本的营养物质(1)所有细胞均需要的各种氨基酸(2)含有适当的葡萄糖以维持细胞代谢及产生能量(3)必需的维生素(4)钠、钾、钙、镁等无机盐类及Fe、Zn、Se等微量元素在大多数培养基中需加入血清，如小牛血清等。为了防止细菌感染，有时加入适量的抗生素(如青、链霉素)。,(三)温度最适宜温度为3537C。偏离此范围，细胞的正常代谢和生长受影响。一般来说，细胞对低温的耐受力较高温强。温度不低于0C时，细胞代谢随温度降低而减慢，对细胞无伤害作用，一旦再置于37C培养，细胞仍能生长。如温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰而死亡，但如向培养基中加入保护剂(二甲基亚砜DMSO或甘油)，封入安瓶中，即可在液氟中冷冻储存(温度达一196C)，复苏后仍能继续生长。,（四）气体环境和氢离于浓度所需气体主要是O2和CO2。大多数培养细胞适宜的pH值为7.27.4，低于6.8或高于7.6对细胞不利，甚至导致细胞死亡。对多数细胞来说，耐受酸性较耐受碱性强，在偏酸环境中更利于细胞生长。为维持培养基pH值的稳定，常以CO2HCO3-和磷酸缓冲液体系来完成。（五）渗透压大多数细胞对渗透压有一定耐受性。对绝大多数细胞来说，最适宜渗透压为230-320mOsm/kg。,二、培养细胞的类型与生命期(一)体外培养细胞的类型和功能,上皮细胞，覆盖在外部（如，皮肤）和内部（如，肠，血管）器官的表面，如内皮细胞；结缔组织细胞，支撑其它身体组织，神经和血管寄生处，如成纤维细胞（ECM产生），软骨细胞，骨细胞；肌肉细胞，专为挛缩，光滑，骨骼，心脏；神经细胞，产生电信号并且分泌神经传递素，如脑细胞，外围神经细胞,皮肤细胞,结缔组织细胞,肌肉细胞,微粒细胞,骨细胞,软骨细胞,(二)培养细胞的生命期体内细胞常处于动态平衡中，其生存期与机体寿命相一致。大多数二倍体(2n)细胞在培养中维持有限生存期，约1年左右。在全生存期中大致经历以下三个阶段：第期；即原代或初代培养期。从体内取出组织或细胞首次在体外进行接种培养，称原代或初代培养。其细胞称原代或初代细胞。当原代培养细胞增殖到一定密度后，需分出部分细胞进行再培养，此过程称传代。从原代培养直到第一次传代期间称原代培养期，一般持续约14周。原代培养细胞呈二倍体核型，与体内细胞性状相似，是较好的实验材料。,第期：即传代期。原代培养细胞一经传代后即称细胞系(cellline)。此期持续时间最长，细胞增殖旺盛并能维持二倍休核型。呈二倍体核型的细胞系称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞宜在原代培养期或传代早期冻存保种。如不冻存则需反复传代而有可能丧失二倍体性质，当传代3050次后细胞进入第期。,第期：衰退期。细胞虽然生存但增殖缓慢或不增殖，以致细胞衰退死亡。在培养细胞生命期阶段的三期中的任何一点，由于某种原因的影响，细胞可发生自发性转化或人工诱发转化，使细胞具有持久增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系或连续细胞系，无限细胞系的形成以发生在第期为主，第期较少。转化后细胞的核型多成异倍体，可能具有恶性化性质。由细胞系分离出来与原系不同的细胞群体称亚系。,三、细胞培养的基本方法(一)原代培养原代组织块培养法原代消化培养法（胰酶、胶原酶）原代细胞培养法(二)传代培养(一)悬浮培养,四、培养细胞生物学性状检测(一)形态学方面1.一般形态观察可作活细胞相差显微镜观察并摄影。固定观察死细胞常用Giemsa染色，比较快速简便,应用其他染色法亦可。形态学方面主要观察：细胞类型归属，细胞的一般形态，如细胞形状、大小、核质比、染色质和核仁大小及多少等。2.超微结构观察超微结构观察有助于比较确切地说明细胞形态特点，如微绒毛的形态、多少、核仁的形态和数量的多少及排列状态等。,(二)细胞增殖生长方面1细胞计数法2细胞分裂指数细胞分裂指数是指被测细胞群每1000个细胞中的分裂细胞数,用以表示细胞增殖旺盛程度。固定染色、制成永久标本后观察。3接种存活率细胞被制成分散的悬液后，以低密度(25个细胞/cm2)被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值称接种存活率，用以表示细胞群的活力。,4MTT测定MTT测定是一个快速简便的颜色反应测定，定量测定细胞的存活比例。活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的MTT溴化3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。由于甲臜的多少可通过酶联免疫检测仪测定其在570nm处的吸收度（OD值）而得知，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。5.培养细胞的同位素自显术常见的是分析细胞内DNA、RNA、蛋白质的合成，通常采用3H标记的DNA、13C标记的RNA前体物，14C、35S标记的氨基酸等结合质谱技术获得。,组织工程支架作为组织工程的平台，不仅提供了细胞生长的框架，使之形成特定的组织或器官形状;而且作为细胞外基质成分之一，是细胞间信号传导和相互作用的媒介，同时也是细胞生长所必需的生物活性剂。,8.3支架设计及制备技术,良好的生物相容性，在生物体内不会引起炎症或致畸反应合适的孔尺寸、高孔隙率和相连的孔形态，以适于细胞的黏附和生长，细胞间的信号传导，养分传送，以及降解产物和新陈代谢产物的排出，以及血管和神经的长入。高的表面积和合适的表面理化性质以利于细胞粘附、增殖和分化,以及负载生长因子等生物信号分子特定的三维外形（厚度和形状）合适的可生物降解吸收性与植入部位组织力学性能相匹配的结构强度,一、组织工程支架的基本条件（设计要求）：,二、支架材料天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷、生物玻璃生物复合材料,天然高分子材料,蛋白质支架胶原明胶多糖支架海藻酸盐壳聚糖透明质酸蛋白质多糖支架,合成聚合物材料,聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物聚乙烯醇聚交酯聚乳酸（PLA）聚（D,L-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA）聚乙交酯（PGA）等,生物陶瓷,磷酸钙陶瓷聚磷酸钙羟基磷灰石珊瑚（碳酸钙）,（一）纤维支架纤维支架是组织工程研究中最早采用的细胞外基质替代物之一，主要由PGA或其共聚物等结晶性聚合物纤维构成。利用纺织技术将直径1015m的纤维制成织物或无纺物，其孔隙率高达97%，比表面积高达0.05m-1，但存在力学强度较差、承压时会坍塌的缺点。,三、支架制备技术,改进：（1）雾化或喷雾涂曾采用PLLA或PLGA溶液涂覆织物的方法，可使相邻纤维间形成物理连结，从而使纤维支架稳定、耐压。（2）热处理溶出PGA纤维浸在PLLA/CH2Cl2溶液中溶剂挥发后PGA嵌入到PLLA中加热到两种聚合物熔点以上，PLLA熔点低，先熔化，充满PGA纤维网络所有空洞（PLLA防止纤维网塌陷作用）。交叉点的PGA纤维熔融后物理缠结在一起。用氯仿溶出PLLA通过织物提高机械性能；类似孔结构,纤维网状结构加工示意图A:PGAB:PLLA,(二)多孔支架,松质骨结构,1.粒子致孔法最常用的是溶液浇注/粒子浸滤聚合物溶液与均一的盐晶混合溶剂挥发后形成固体的聚合物/盐复合物浸没在水中去除盐可控孔隙率达93%（厚度2mm）,当盐晶含量为7090时，有均匀的联孔结构,致孔剂粒子可采用氯化钠、酒石酸钠和柠檬酸钠等水溶性无机盐或糖粒子，也可用石蜡粒子或冰粒子。溶液浇铸/粒子浸滤法制备多孔支架时易形成致密的皮层，若浇铸后不断地振动至大部分溶剂挥发，可防止粒子沉降，抑制表面皮层的形成。（非溶剂聚沉）粒子致孔法简单、适用性广，孔隙率和孔尺寸易独立调节，是一个通用的方法，得到了广泛的应用，但致孔时往往需用到有机溶剂。,形成气体的盐致孔水溶性致孔剂致孔冰晶致孔,GuopingChen,etal.Developmentofbiodegradableporousscaffoldsfortissueengineering.MaterialsScienceandEngineering,2001;C17:639,Morphologyofcross-sectionsofPLLAsponges,2.热致相分离（TIPS）,相分离法是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷冻过程中发生相分离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。因而，相分离法又往往称为冷冻干燥法。按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。,均向聚合物溶液：高温低温淬火热力学状态参数：溶液浓度、冷冻温度、冷冻时间和冷冻速率等,液液相分离相图,PorousPDLLA/BioglassscompositescaffoldspreparedbyTIPS：bimodalandanisotropicporestructurescomposedoftubularmacroporesof100m,interconnectedwithmicroporesof1050mindiameter(冷却到L-S相平衡线以下干燥),溶液冷冻干燥,WhangK,etal.Anovelmethodtofabricatebioabsorbablescaffolds.Polymer1995,36:837-42,乳液冷冻干燥,Ming-HuaHo,etal.Preparationofporousscaffoldsbyusingfreeze-extractionandfreeze-gelationmethods.Biomaterials2004;25:12938,温度低于溶液凝结点,Morphologyofthechitosanandalginatescaffolds,水凝胶冷冻干燥（明胶、藻酸盐和壳聚糖等水凝胶）,不同温度下，多步相分离粗化，提高孔尺寸、连通性,相分离/冷冻干燥法孔尺寸往往偏小，但该法避免了高温，因而得到了研究者的重视。,改进：,（1）超临界流体技术（物理发泡法）该法将聚合物压成片,浸泡在高压二氧化碳中直至饱和,甚至超临界状态,然后降至常压,气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长,形成多孔支架。,3.气体发泡法,超临界二氧化碳（SCCO2）无残留溶剂制备非晶相聚合物支架,优点：不使用有机溶剂，因为残留在支架中的有机溶剂对细胞有害;反应体系可以在比较低的温度下进行（3040C）,便于药物和生长因子的粘附。缺点：支架的孔隙率和孔径不可控，由气体在固体中溶解/释放过程的形态决定；连通率低（1030）；闭孔结构，可联合粒子浸滤法改进。,（2）化学发泡法化学发泡法来制备多孔支架,采用的化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液/碳酸氢铵粒子混合物加入到模具中,待溶剂部分挥发后直接浸入热水中发泡,最后经冷冻干燥可得到多孔支架。该法得到的多孔支架孔隙率超过90%,孔相连性好,孔尺寸约100500m,并避免了表面皮层的形成。,4.微球聚集法,将可降解聚合物微球加入模具中,加热至玻璃化温度以上,保持一定时间后冷却、脱模可制得烧结微球支架。热处理时微球相互接触处由于链运动而连结在一起,冷却至室温后该结构被固定下来,因而得到多孔的烧结微球支架。,FabricationprocessofacompositeofPLAGAandBG.Thecompositewaspreparedina3-D,porousscaffoldbymicrospheresintering.,PVA,LUetal.JBiomedMaterRes64A:465474,2003,微球紧密堆积产生的孔隙成为支架的孔,孔尺寸范围为37150m,与微球尺寸成正比,孔隙率则随微球尺寸增大略有增加,为3139%,孔相连性很好。,该法优点在于孔相连性好,孔尺寸易调控,力学强度大,微球可包裹药物、生长因子，进行可控释放。缺点则在于孔尺寸偏小,孔隙率亦低。,5、静电纺丝,优点：操作简单，制品比表面积大缺点：耗时长、效率低、可控性差，纤维难以排布规则,6.3D印刷浇铸聚合物粉基础（如：PLGA）按希望的分布点“印”微米体积的溶剂液滴（氯仿）当溶剂挥发时凝结的粉固化重复以上操作，建立3D结构摇出未凝结的粉精确性结构型微孔聚合物或陶瓷支架,Typicalmorphologiesofporouspolymerfoamsproducedbysolidfreeformfabricationtechnique,快速成型法可一步形成支架的外形和相连的多孔结构,是一种一体化制备方法。优点:成型时间短,利于自动化大规模生产;可根据个体的不同,迅速制备出具有个体特征的三维多孔支架;可制备各个部位具有不同孔结构的支架以适应复合组织的不同要求。缺点：支架孔隙率偏低,通常小于80%.改进？,7.相连管状孔道支架将糖纤维等水溶性纤维材料预先构建成具有特定结构的三维“负”支架,“负”支架经水蒸汽处理后形成连结.将聚合物溶液滴在“负”支架上,冷冻使聚合物溶液凝胶化,用水浸出糖纤维冷冻干燥脱除溶剂,得到的多孔支架具有预先设计的相连管状孔道结构,孔隙率高达90%以上,并具有纳米纤维孔壁结构。,“负”支架的构建既可手工完成,也可用快速成型技术来实现自动化。与通常的快速成型技术不同的是,首先形成的是最终的多孔支架的“负”复制品。该支架的相连管状孔道结构更有利于支架内的传质过程,其纳米纤维孔壁结构则更有利于细胞粘附。,支架设计及制备技术,表：三维支架制备技术,（三）注射型组织再生支架（软支架）,可注射型支架是将一种具有流动性的生物相容性良好的材料与异体或自体细胞复合后注射到机体缺损部位,或直接注人体内,材料到达缺损部位后能在原位形成具有一定机械强度、形状并且可与体液进行交换的支架。支架通过注射完成植入,故可降低手术难度,减少手术创伤,特别适用于微创伤的修复。,高长有,马列.医用高分子材料.P229-234.洪奕等.注射型组织再生支架的研究进展.生物医学工程学杂志,2007;24(2):463-465.,可注射型支架在组织工程中应用的示意图,水凝胶具有在一定条件下可保持流动状态而在外部的物理或化学刺激下可形成一定形状和强度的体型材料的特性,因此成为可注射型支架的首选材料。,水凝胶作为可注射型支架优点：具有良好生物相容性；水溶液环境有利于保护细胞以及营养物和分泌产物的运输；易用细胞粘附配体进行改性。水凝胶作为可注射型支架缺点：水凝胶的操作不易控制,机械强度较低，消毒困难。,1.温敏型水凝胶类可注射支架:温敏型水凝胶是指当一定浓度的溶液在温度升高或降低到一定值时可迅速形成凝胶,可分为升温型水凝胶和降温型水凝胶。由于温敏型水凝胶只需通过改变温度就可凝胶化,大大降低了外界物质对细胞的影响,因此用于可注射型支架具有一定的优越性。例如：降温型：琼脂；升温型：PEO、胶原、PNIPAm接枝明胶,2.交联型水凝胶类可注射支架指在添加助剂或者引发剂后,分子链间发生交联形成水凝胶。交联方式有共价键交联,离子键交联等。交联也可通过光引发来进行。如：聚反丁烯二酸丙二醇酯（PPF）通过主链上的双键和含双键的单体或低聚物进行交联原位形成凝胶。为减小温度、添加交联剂及引发剂,对细胞的活性的影响,可采取微囊化复合改进。如，Payne等将骨髓间质成骨干细胞微囊化后种植在水凝胶以保持细胞活性。,3.复合水凝胶型可注射型支架以水凝胶为载体的可注射型支架主要用于骨修复,一般是采用微粒与水凝胶材料以适当比例共混,保持流动性,然后将混合物注射到缺损部位后凝胶化。目前报道最多的是以羟丙基甲基纤维素水凝胶与具生物活性的磷酸钙(BCP)复合以制备可注射型骨替代物一。纤维素类水凝胶是一类升温型水凝胶,可以通过纤维素浓度来控制凝胶化的温度范围。,组织修复中的可注射型材料,PPF：聚反丁烯二酸丙二醇酯,可注射型支架研究中存在的问题:如何提高水凝胶的强度凝胶化的可控性对于预制备降温型、交联型等水凝胶时与细胞的复合问题等。,MicrospheresBiodegradablePLGAmicrosphereshavebeenstudiedfordeliveryofchondrocytesforcartilageengineering.Non-porousPLGAmicrospherescouldbeusedas(i)amicrocarrierforcellexpansioninvitro130,priortouseasan(ii)injectablecarrierforcartilageregenerationinvivo131133.Werecentlyreportedthathighlyporousmicrospheres(200minoveralldiameterand30minporediameter)couldbepreparedbyagasfoamingmethod29.Theseporousscaffoldmicrospherescouldbeusedformicrocarriersuspensioncultureofcells,aswellasinjectionofthecell/microsphereconstructsintoatissuedefectsite(Fig.5).Theseinjectableandporousmicrosphereswouldprovideagreatadvantageforcelltherapyinmanyaspects.Priortoinjection,theporousstructure(30m)wouldallowsufficientcellseedinginandoutofthematrix.Afterinjectioninvivo,theporousmatrixwouldpermitinfiltrationofcellsandin-growthoftissuefromthehost,facilitatingtheregenerationprocess.,H.J.Chung,T.G.Park/AdvancedDrugDeliveryReviews59(2007)249262,Fig.5.Useofinjectableporousscaffoldmicrospheresforcartilagetissueengineeringasanexample.Primarychondrocytesareseededwithinporousscaffoldmicrospheres,expandedinvitro,andtheninjectedoralternativelyimplantedasaculturedtissueintoacartilagedefectsite.,软骨细胞,（四）天然组织工程支架,天然支架是利用天然材料本身存在的疏松或多孔状结构，通过一定的制备方法得到的多孔支架材料。例如，利用直接或完全替代的原理，用其它个体的骨组织的无机部分作为支架材料。异种骨异体骨（脱钙骨、冻干骨）海珊瑚,五、组织工程支架的发展,不同材料间的复合生长因子的引入物理结构上的仿生化（多层次）,理想组织工程支架模式图,生物材料表面改性方法,生物大分子的表面固定化,将具有生物活性的大分子通过物理吸附、包埋或化学键合的方法固定在材料的表面,生物活性大分子：ECM黏附蛋白（纤连蛋白、层连蛋白）ECM多糖及其类似物（透明质酸、壳聚糖）细胞黏附多肽（RGD）细胞活性因子,注：RGD系含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的促进细胞粘附的寡肽,8.4组织工程中的微胶囊技术,一、微胶囊概论微胶囊是指以高分子膜为外壳、其中包有被保护或被密封的物质的微小包囊物。就像鱼肝油丸那样，外面是一个明胶胶囊,里面是液态的鱼肝油。经过这样处理，鱼肝油由液体变成了固体。微胶囊的颗粒直径要比传统的鱼肝油丸小得多，尺寸范围在零点几微米至几千微米之间，一般为5-200m。,单核,多核,多核，不规则外形,双璧,微胶囊簇,含微胶囊之微胶囊,微胶囊内被包裹的物质通常称为芯（core）、核（nucleus）或填充物（fill）；外壁称为皮（skin）、壳（shell）或保护膜（protectivefilm）。微胶囊中所包裹的物质，可以是液体、固体粉末，也可是气体。由于应用目的和制造工艺不同，微胶囊的大小、形状可有很大变化，其包裹形式也有多种。常见的有:,生物微胶囊的概念将酶、蛋白质和激素等生物活性物质或微生物、动植物细胞包封在亲水性的选择性透过膜中,形成的球状微胶囊,称之为生物微胶囊。,1957年，Chang首次报道生物活性物质的微囊化(ChangTMS.Hemoglobincorpuscles.ResearchReportforHonoursPhysiology.MedicalLibrary,McGillUniversity,1957)60年代中期,Chang又指出了生物微胶囊在临床及其他生物学应用上的可行性.(ChangTMS.Semipermeablemicrocapsules.Science,1964,146:524525),通过微胶囊膜的选择透过作用,使囊外大于某一分子量的物质不能扩散进入,而生物环境中的营养成分和囊内生物活性物质或细胞分泌的小分子产物可以自由出入微胶囊,从而达到免疫隔离目的,生物微胶囊示意图,方法：1把需要的细胞密封在半透膜中2植入密封装置或与体内连接3细胞分泌物治疗4当治疗完成时装置取出或断开连接,80年代初,人工胰腺：将微囊化技术与组织细胞移