免疫组化技术标准化的探讨

文章编号:1007- 8738( 2011) 08- 0927- 03 免疫组化技术标准化的探讨 王文勇 1, 黄晓峰2* , 王映梅 1, 赵一岭1, 马福成1, 王伯沄1 (第四军医大学: 1病理学与病理生理学教研室, 肿瘤生物学国家重点实验室,2中心实验室, 陕西 西安 710032) 收稿日期: 2011- 03- 15; ? 接受日期:2011- 04- 30 基金项目: 陕西省自然科学基金资助项目 ( SJ?ZT 10 ;2009J M4006); 陕西省社发公关项目 ( 2010K15?03?07) 作者简介: 王文勇 ( 1963- ), 男, 四川巴中人, 高级实验师 Te: l 029?84773921 ; E? mai: l wwyong fmmu . edu . cn * Corresponding author , E? mai: l huangx ff mmu. edu . cn 关键词 免疫组织化学; 标准化; 实验室认证 中图分类号 R392. 11? ? ?文献标识码 A ? ? 免疫组织化学技术由 Coons首创于 1950年, 刘彦仿等 1 于 1965年在国内首先建立了免疫组织化学技术。该技术经 历了 4个发展阶段: 免疫组织化学各种方法不断建立和发展 阶段; 推广普及阶段; 用于临床病理诊断及广泛应用阶段; 该技术标准化、规范化及质量控制阶段。该技术具有很高的 特异性、灵敏性、简便性, 能将形态和功能代谢相结合, 定 性、定位和定量相结合, 基因水平和蛋白质水平检测相结合, 细胞水平和超微结构水平相结合。因此, 免疫组织化学技术 已广泛应用于生命科学和医学各个领域的研究和诊断中, 已 从技术发展成为一门新的学科 2。随着免疫组化各种方法的 建立和运用, 极大促进了该技术的发展, 并为免疫组化技术 在病理学诊断中的迅速普及应用打下了坚实的基础。但随着 国内免疫组化技术日益广泛应用, 更加认识到免疫组化技术 标准化的必要性和紧迫性, 免疫组化标准化是保证结果可靠 性、可重复性的重要前提 3。我们认为免疫组化技术标准化 主要体现在以下几方面: 免疫组化染色前技术的标准化 (组 织固定、取材、脱水、包埋的标准化 ); 组织制片标准化; 抗 原修复标准化; 对照实验正确设立; 试剂标准化 (抗体和检测 系统标准化 ); 免疫组化具体操作步骤的标准化; 免疫组化染 色结果判读标准化; 医学实验室认证。 1? 免疫组化染色前技术的标准化 免疫组化要求组织离体后立即固定, 理想取材厚度 2mm, 组织在脱水机中的处理条件应十分妥当。大量的实验发现在 加热抗原修复过程中造成组织脱片的主要原因是取材过厚固 定不佳以及脱水、浸蜡处理不当所致。如果 HE染色做不出满 意的染色结果, 那么免疫组化染色根本无法保证质量 4。 固定是保存组织原有形态结构, 防止组织抗原弥散丢失、 保存组织抗原性的关键, 因此离体组织必须立即固定。但这 不是仅仅是病理科的工作, 必须和手术送检科室进行配合, 才能做好固定标准化工作。离体组织固定尽量不要超 过 15 min ; 食道、胃肠、胆囊和膀胱等空腔脏器需根据规范方法 剪开后再固定; 肝脏、脾脏等实质器官需由背面, 沿长轴每 隔 2 c m纵向平行剖开, 切成数片再固定; 微小组织和液体沉 淀物需先用拭纸或滤纸包好后再固定; 免疫组化常用的固定 液首选 pH7. 2的 100mL /L中性福尔马林固定液 (配方如下: 40 g /L 多聚甲醛 100 mL, 磷酸二氢纳 0 . 44 g , 磷酸氢二钠 2. 58 g , 蒸馏水 900mL)。固定液的量一般为组织块总体积的 5 10倍, 使用标准的固定容器。 2? 组织制片标准化 2. 1? 切片防脱片标准化处理 ? 防脱玻片的处理各实验室多 采用不同的黏附剂, 目前常用的是氨丙基三乙氧基硅烷 ( 3? a m inopropyltriethoxy?silane , APES)和多聚左旋赖氨酸硅化玻 片, 不论是免疫组化还是原位杂交该黏附剂都具有极好的防 脱片效果 4- 5。 2. 2? 切片标准化? 使用一次性切片刀, 具有切片完整性好、 刀痕较少、切片较薄、染色质量高的优点。切片厚度应在 3 5 ?m, 这样的切片免疫组化阳性结果定位清晰。切片过厚不 仅容易脱片, 还影响免疫反应及镜下观察。组织切片后应在 56 60? 恒温箱烤 2 3 h防脱片 4。 3? 抗原修复标准化 福尔马林固定组织导致组织中抗原决定簇封闭, 也就是 组织细胞经福尔马林固定后, 导致抗原决定簇的三维结构发 生异常改变, 使抗原决定簇被掩盖或原来位于表面的一些抗 原决定簇因折叠而形成隐蔽的抗原决定簇 6- 7。因此抗原的 的理化性质发生了显著的变化, 表位空间结构改变导致许多 抗原免疫活性丢失。但这一变化是可逆的, 可通过抗原修复 的方法来修复抗原 4。目前, 抗原修复有两种方法: 酶消化 法和热修复法。 3. 1? 酶消化法 ? 消化酶的作用在于能够暴露因组织固定而 导致的抗原决定簇的封闭, 以增强染色效果。消化酶有多种, 如胰酶、蛋白酶 K、胃蛋白酶等, 只有少数抗体可以选择酶消 化法。由于加热抗原修复法的广泛使用, 酶消方法在免疫组 化中的应用已越来越少 3。 3. 2? 加热抗原修复法?Shi等 8报道, 其机制可能是加热打 开了组织抗原因福尔马林固定引起的抗原决定簇的交联。某 些研究表明组织中钙结合 (或其他二价阳离子 )也可能是重要 的影响因素 3。热修复方法主要有: 高压、微波和水浴等修 复法。高压抗原修复方法优于其他修复法 3- 4。 3. 3? 高温抗原修复的具体方法? 将 1 500 2 000mL抗原修 复液倒入高压锅内, 用电炉或电磁炉加热煮沸, 然后将置于 耐高温塑料切片架上的脱蜡水化后的组织切片轻轻放入高压 锅内, 使组织切片位于液面下, 盖紧锅、压阀并加热, 盖子喷 927ISSN1007- 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin JCellM ol I mmunol)2011 , 27(8) 气开始计时, 控制时间为 15 min, 关闭电源, 将高压锅置于水 龙头下冲 5 min , 打开高压锅锅盖继续冷却后, PBS振洗 9。 3. 4? 抗原修复液的选择? 加热抗原修复缓冲液有多种如柠檬 酸盐缓冲液 ( p H6 . 0)、Tris( pH7 8)、EDTA( pH8. 0)等目前首 选柠檬酸盐缓冲液 ( pH6. 0), 优点是染色背景清晰, 适合于大 多数抗体。T ris和 EDTA 两种修复液对部分抗原修复效果较 强, 但其染色背景同时加深, 如使用不当易造成假阳性结果。 值得注意的是, 没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体, 柠 檬酸盐缓冲液 ( pH6 . 0)可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓 冲液, 但也不能除外某些抗体适于用 EDTA 和 Tris缓冲修复 液。一般抗原比较难于表达的抗体多选择后两者 10。 4? 对照实验正确设立 首先我们要求在每一次免疫组化染色过程中必须严格设 立对照: 阳性对照、组织芯片内对照和阴性对照。阳性对照: 选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色, 阳性切片应呈 阳性, 此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者更 应设阳性对照。组织芯片内对照: 利用均经免疫组化染色证 实与不同抗体呈阳性反应的多种组织, 制成组织芯片用作染 色的阳性内对照 11。与传统的阳性对照片相比, 组织芯片阳 性对照片具有效率更高, 参考值更多、更科学, 并且简便易 行, 值得推广 12。阴性对照: 选用已知染色阴性的组织切片 染色, 其结果应为阴性, 一般来说, 阴性对照和阳性对照同 时进行。 5? 试剂标准化 免疫组织化学的各个环节都标准化有一定难度。但首先 要实现试剂的标准化, 即所用抗体和检测系统必须标准化。 应由国家有关部门管理和制定统一标准, 成立专门的机构 (或指定机构 )对进入市场的国内外生产的免疫组织化学试剂 进行检测认证, 经过审批符合标准后, 才能批准进入市场。 我国应参照美国 FDA 的相关规定, 严格审批进入市场的国内 外生产的免疫组织化学试剂, 这是标准化的首要条件。 5. 1? 一抗标准化? 一抗即用型抗体, 生产厂家已进行多种实 验条件检测, 目前可按照厂家提供的操作条件进行实验。这 是一抗标准化发展的方向 10, 以后应纳入国家管理和认证。 5. 2? 检测系统标准化? 目前, 免疫组化标准化是建立在福尔 马林固定、石蜡包埋的组织切片的基础上, 并采用非生物素 型酶聚合物检测方法开展的。非生物素型酶聚合物法免疫组 化检测系统的出现, 可以有效地防止内源性生物素干扰, 并 且灵敏度高, 操作便捷, 已被免疫组化实验室广泛应用, 是 免疫组化标准化首选的染色方法 4。如 EnV ison , Eli V ision和 PowerV ision检测系统等 6。 6? 免疫组化具体操作步骤的标准化 免疫组化染色方法分手工和机器操作, 最终使用全自动 免疫组化染色仪操作必将代替手工染色。以 EnV ison法为例 简述如下:( 1)手工具体操作步骤: 组织切片脱蜡至水; 高温 抗原修复 (根据一抗情况决定是否需要抗原修复 ); 30 mL /L H2O2水溶液封闭 30 m in(H2O2应混合均匀并在密闭容器中 处理 ); 1% 的非免疫血清孵育 15 m in后, 吸干; 滴加一抗 37? 温箱孵育 40 m in ; 滴加 EnV ison复合物 37? 温箱孵育 40 m in; 以上过程除加非免疫血清步骤外, 均用 PBS ( pH7. 2 0. 01 mol/L)振洗 5m in, 2次; DAB/H2O2显色 1 5m in; 片 水洗、苏木素复染、脱水、透明、封固。 ( 2)全自动免疫组化 染色仪染色 13- 14: 手工实际操作可因各种因素而得不到稳定 理想的结果。全自动免疫组化染色仪具有全开放、W indows 编程、切片条码识别、应急加片等功能。不仅省时省力, 而 且实验结果更准确、更科学也更标准化。罗氏公司的 Bench? mark XT 全自动多功能组织病理检测系统, 可以实现每张切 片独立温控; 支持多种实验方案 (免疫组化、原位杂交、显色 原位杂交及免疫荧光组织化学染色 ); 支持多种样本 (石蜡切 片、冰冻切片、细胞学样本 ); 支持多种染色方式 (单染 /双染 / 多重染色 ); 支持多种反应温度同时监控; 支持多种抗原修复 方式; 支持多种复染方式。为免疫组化标准化提供了很好的 条件。 7? 免疫组化染色结果判读标准化 免疫组化染色的最终目的是要得出一个正确的结果, 但 同一张免疫组化染色的切片不同的人观察可能会得出不同的 病理诊断。怎样才能避免这种情况的出现, 如何才能从同一 张免疫组化结果不同病理医师观察都能得出相同正确的病理 诊断, 这就提出了免疫组化染色结果判读标准化问题。免疫 组化结果判断时首先要看阳性内对照的情况, 其次要分析阳 性染色的部位是否正确, 再次之一定要结合 HE染色切片确 定免疫染色阳性的组织或细胞是否为肿瘤或有意义的组织和 细胞。如: 评价免疫组化染色是否成功最好比较同一张切片 中存在的正常组织, 即所谓的内阳性对照 15, 如细胞角蛋白 染色时查看周围或肿瘤中残余的正常上皮是否阳性; 平滑肌 肌动蛋白、CD34染色时查看肿瘤中血管阳性的表达; 雌激素 受体染色时查看正常乳腺腺泡的细胞核是否阳性, 淋巴瘤中 反应的或残余淋巴组织的免疫反应 (任何一例淋巴瘤组织中 总会存在多少不等反应或残余的 T或 B细胞, 若全部细胞阴 性则表明假阴性 )等。当然, 有不少染色或病例缺乏内阳性 对照, 若对染色反应有疑问只能选用另外的阳性对照片核实。 若内或外阳性对照组织免疫染色阴性, 瘤组织阳性则表明假 阳性; 瘤组织阴性则表明假阴性。只有阳性对照染色阳性瘤 组织染色才属真实。除了观察内阳性对照外, 还要看内阴性 对照是否有非特异性反应。总之, 只有阳性对照染色阳性, 阴性对照组织阴性, 这样的免疫组化染色结果才可信。 分析阳性染色的部位是否正确, 如许多淋巴细胞的标志 (CD4、CD5、CD8、CD20、CD30、CD43、CD45RB等 ), 应为细 胞膜阳性, 若胞质弥漫阳性或细胞核阳性则为假阳性。反之, 有的抗体染色应为核阳性 (如雌激素受体、孕激素受体、K i? 67 、细胞周期素 D1等 ), 若胞质或胞膜阳性也为假阳性。还 有的抗体可表现为二种阳性反应类型, 如 S?100可为核阳性 也可伴有胞质阳性; CD30 、CD15既可表现为细胞膜阳性, 也 可表现为核旁高尔基区阳性。随着对免疫反应靶分子部位的 928ISSN1007- 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J CellM ol I mmunol) 2011, 27( 8) 更深入了解, 人们近年来还提出免疫反应的形态也是重要参 考依据 15- 16, 如嗜铬蛋白 A 等阳性反应在胞质内应呈颗粒 状, 而 CD79a等为胞质弥漫阳性, 细胞角蛋白染色阳性应为 胞质丝状等等, 若染色类型不符合可能也要怀疑为假阳性。 但要精确观察到阳性反应的细微类型表现必须切片薄, 并采 用高分辨率的显色系统。一定要结合 HE染色切片确定免疫 反应阳性的组织或细胞是否为肿瘤或有意义的组织、细胞。 如果肿瘤成分较多, 与周围间质界限清楚时容易确定阳性反 应, 但若肿瘤成分较少, 弥散存在, 可能会将周围反应性成 分或残余组织的阳性反应误认为肿瘤阳性, 导致错误的诊断。 如伴有大量淋巴细胞浸润的未分化癌 (未分化鼻咽癌 ), 富于 T 细胞的大 B细胞淋巴瘤, 瘤组织中残余的横纹肌, 脂肪组 织等。还有的细胞 (如肥大细胞 )可对多种抗体表达阳性反 应, 应注意区别。 8? 医学实验室认证 医学实验室的认证是由权威性的机构对于医学实验室按 照一定的标准进行评估和检查后, 对于符合标准的实验室给 予认证通过。目的在于提高各实验室的总体水平和技术标 准, 改进缺陷和不足, 使得医学实验室的检查结果标准化, 更加有利于对疾病的诊断和治疗。也是免疫组化技术标准化 的一个重要方面。它属于国际标准化组织工作的一部分。 ISO9002标准中对于实验室的认证有共同的要求。我国在这 方面虽然起步较晚, 但已引起医学界和政府有关部门 (包括 各个省市卫生厅局 )的足够重视。有关工作已见诸报刊杂志, 特别是专业学术团体和许多城市在几年前就开始了关于加强 质量控制和标准化的工作。中华医学会在卫生部的领导下于 2004年就编写了?临床技术操作规范?, 中华医学会病理分会 以及中华医学会病理分会技术组已做了大量的工作。我们相 信在不久的将来, 在政府有关方面的支持和学会的领导下, 我国的实验室认证工作达到一个新的水平。 总之, 免疫组化技术是一门看似简单, 实际却较复杂的 综合实验技术, 因此免疫组化标准化、规范化是一个复杂的 系统工程, 只能在主要环节达到标准化, 并取得良好的染色 结果。良好的染色结果才是免疫组化技术标准化的目的, 一 切应围绕这个中心。我们应根据各个实验室自己的情况, 结 合国内外技术、理论发展情况和经验来设定自己的标准化。 参考文献: 1 刘彦仿, 王伯沄. 抗肝血清所致大鼠肝炎的荧光抗体及组织化学 观察 J. 中华病理学杂志, 1965, 9( 3) 203- 205. 2 王伯沄, 王文勇. 免疫组织化学的新进展 A . 王伯沄、王文勇 主编. 病理学技术进展 M . 全军第六届病理技术学术会议论文 汇编, 2009: 10- 11. 3 王? 丽, 张秋金, 林齐心, 等. 初论免疫组化标准化 (一 ) J. 诊 断病理学杂志, 2003 ,10( 5): 310- 311 . 4 王小亚, 崔全才. 免疫组织化学标准化及质量控制 A . 吴秉铨, 刘彦仿主编. 免疫组织化学病理诊断 M . 北京. 北京科学技术 出版社,2007: 46- 61. 5 梁英杰. 免疫组织化学技术制片的规范和质量控制 J. 中国组 织化学与细胞化学杂志, 2004 , 13( 2): 262- 264. 6 吴秉铨, 刘彦仿. 免疫组织化学病理诊断 M . 北京. 北京科学 技术出版社, 2007: 15- 22. 7 熊正文. 免疫组织化学技术中抗原修复的研究进展 J. 中华病 理学杂志, 1997, 26( 2): 124- 125 . 8 Shi SR, Key ME, K alraKL. Antigen retrieval in for malin?fixed, par ? affin?embedded tissues :an enhancement method for i mmunohisto? chemistry staining based onm icrowave oven heating of tissue sections J.JH istochem Cytochem, 1991, 39( 6): 741- 748 . 9 余杏娟,