3第三章培养基及制备.ppt

第三章：培养基及制备,第一节培养基配制原则第二节工业发酵培养基第三节淀粉水解糖的制备第四节糖蜜原料的预处理,第一节培养基配制原则一、工业发酵培养基的要求,培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。,二、培养基配置原则,1.根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基2.营养成分的恰当配比（C、N比）3.渗透压（产量要求、产物积累造成高渗透压）4.PH值（霉菌、酵母菌适酸性，放线菌和细菌适中性或微碱性）5.氧化还原电位（针对厌氧发酵）为避免沉淀,营养成分的加入顺序一般为:先加入缓冲化合物,溶解后加入主要物质,然后加入维生素、氨基酸等生长素类物质。,三、培养基成分配比的选择1.碳氮等各元素比,酵母细胞中C、N比约为100：20霉菌细胞中C、N比约为100：10由于微生物生长阶段碳既作碳架又作能源，所以用量比氮多。一般发酵工业中碳氮比为100：（0.22.0）但氨基酸发酵中因产物中还有氮，所以碳氮比高，为100：（1521）,微生物细胞化学组成成分析表明，与其他高等动植物细胞一样，细胞也是几大元素碳、氢、氧、氮、磷、硫（这六种元素占细菌细胞干重的97，）和微量元素铁、锰、锌等构成。微生物细胞中这些元素主要以蛋白质、糖、脂肪、核酸、维生素及它们的降解产物、代谢产物等有机物质，水和无机盐等无机物质的形式存在。水是细胞中的一种主要成分，一般可占细胞鲜重的90左右。,微生物细胞的化学组成,微生物细胞的化学组成,2.根据物料平衡计算,如酒精发酵：（C6H10O5）n+H2On（C6H12O6）C6H12O62C2H5OH+2CO2+H2O100Kg淀粉理论上可以产酒精X=（246100）/182=56.79Kg,3.根据试验培养基设计的步骤根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基组成；当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。,正交试验设计简介,相关专业术语【试验指标】作为试验研究过程的因变量，常为试验结果特征的量【因素】作试验研究过程的自变量，常常是造成试验指标按某种规律发生变化的原因【水平】试验中因素所处的具体状态或情况，又称为等级,试验设计方法,如何合理安排试验试验所得的数据如何分析,试验指标,因素,水平等级,L9（34）,常见正交表,各列水平均为2的常用正交表有：L4（23），L8（27），L12（211），L16（215），L20（219），L32（231）各列水平数均为3的常用正交表有：L9（34），L27（313）各列水平数均为4的常用正交表有：L16（45）,原培养基:,类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健,初步确定可能的培养基成分(以碳源、氮源为例),通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例),考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源,进一步：乙酸钠的浓度0.2%比较好,结果：,碳源：乙酸钠0.2%,氮源：氯化铵0.2%酵母膏0.03%,无机盐:复合无机盐0.005%,正交设计确定优化的配方,R(极差）1.5320.3912.2090.514,作实验因素与指标趋势图,其最优组合是A1B2C3D1即0.2%乙酸钠、0.2%NH4Cl、0.05%酵母膏、0.05%无机盐,数据处理,极差分析法极差：各因素各水平对应的试验指标平均值的最大值与最小值之差某因素的极差最大，表示该因素在试验范围内变化时，使试验指标数值的变化最大。,试验指标随各因素的变化趋势为了能更直观地看到变化趋势，常将计算结果绘制成试验指标随各因素的变化趋势图。极差分析法是在极差分析的基础上对数据进一步分析，得出各因素对试验指标的影响是否显著,改进后培养基,原培养基,发酵培养基,改进后培养基的发酵结果,四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方,摇瓶、反应器培养基研究的两个层次,摇瓶培养基设计的第一步,反应器最终的优化的基础配方,例：,青霉素发酵,发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%轻质碳酸钙1%,发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%补加硫酸、前体等,摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大,摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础,发酵罐：反应器水平,可以得出最终优化的基础配方,第二节工业发酵培养基,微生物的营养包括：碳源：糖类、有机酸等有机碳，CO2等无机碳。氮源：无机氮、有机氮，以及N2无机盐：K、Na、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn等。生长因子：生物素、硫胺素、肌醇等对缺陷型微生物是必不可少的。生物体内各种生化作用必须在水溶液中进行，营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被微生物利用。另外有些产品的生产还需要使用诱导剂、前体和促进剂。,实例p53,一、工业上常用的碳源,在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。使用最广的碳水化合物是玉米淀粉，也可使用其他农作物，如大米、马铃薯、番薯、木薯淀粉等。淀粉可用酸法或酶法水解产生葡萄糖，满足生产使用。P53表3-1是工业上常用的碳源及其来源。,微生物的碳源谱,麦芽的碳水化合物组成,大麦经发芽制成麦芽，除了淀粉外，麦芽还含有许多糖分。麦芽是啤酒生产的主要原料或唯一原料，其碳水化合物组成见表。麦芽汁也可由发芽的其他谷物制备得到。表3-3麦芽的碳水化合物组成(总干重),工业上常用的糖类,葡萄糖,葡萄糖是最容易利用的碳源，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，且吸收和利用都很快，可称为活性碳源.但是会引起葡萄糖效应：所有迅速代谢能源都能阻抑较慢代谢的能源所需酶的合成。酶的生成被易分解碳源所阻遏。此称葡萄糖效应。,工业上常用淀粉水解糖,淀粉在发酵工业中被普遍使用，通过水解得到葡萄糖。其价格低廉。但是糖液必须达到一定的质量指标。常用的淀粉有玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉。,不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大,糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。,糖蜜使用的注意点：,除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）,预处理：澄清脱钙脱除生物素,例：柠檬酸发酵,有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,预处理：黄血盐,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,不足：难利用发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶成分比较复杂有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应,例：地衣牙孢杆菌生产-淀粉酶,碳源对生长和产酶的影响,碳源细胞量-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2,二、工业上常用的氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1、无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之为迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO42NH3+2H2SO4NaNO3+4H2NH3+2H2O+NaOH,生理酸性物质：经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮源。如硫酸胺生理碱性物质：若菌体代谢后能产生碱性物质的无机氮源。如硝酸钠正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH,无机氮源,微生物的氮源谱,2、有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。,例玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸较多的乳酸硫、磷、等微量元素等,工业上常用的氮源及含氮量（质量分数）%p54,三、无机盐及微量元素,大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。（微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L）微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等。（微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L）一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。以上物质作为其生理活性物质的组成和生理活性作用的调节物。,这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用,一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加。,B.使用时注意盐的形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，PH对酶活的影响pH酶活（分钟）不加4.25120加K2HPO45.4530加KH2PO44.6275,使用注意点,A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑,例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml发酵罐必须进行表面处理,四、生长因子,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。功能：构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的，对于营养缺陷型才是必不可少的。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,B1,核黄素,B6,CoA,生物素,生物素的作用主要影响谷氨酸产生菌细胞膜的通透性，同时也影响菌体的代谢途径。谷氨酸发酵最适的生物素浓度随菌种、碳源种类和浓度以及供氧条件不同而异，一般为5gL左右,为“亚适量”。生物素是B族维生素的一种，又叫做维生素H或辅酶R，其结构式如下：,某些有机氮源的主要成分p56,玉米浆的成分p57,其他提供生长因子的原料：麸皮水解液糖蜜酵母,前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,五、前体物质和促进剂1.前体物质,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,氨基酸发酵的前体物质p58,用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率,不同浓度的前体物质对青霉素产量的影响,2.发酵过程中的产物促进剂和抑制剂,促进剂/抑制剂：对发酵起一定促进或者抑制作用的物质，既不属于营养物质又不是前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。,抗生素的抑制剂p59,第三节淀粉水解糖的制备,一、淀粉水解糖的制备方法1.酸解法2.酶解法3.酸酶结合法,1、淀粉酸水解淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生着：水解反应、复合反应、分解反应；在淀粉糖化过程中，这三种化学反应的关系如下：,高温、高压、,复合反应：葡萄糖分子间经1-6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。分解反应：葡萄糖羟甲基糠醛有机酸、色素等。其中水解反应是主要的。3.影响酸水解的因素酸的种类主要因素浓度水解温度除了淀粉的水解反应外，尚有副反应的发生，这将造成葡萄糖的损失而使淀粉的转化率降低。,2.酶解法,利用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺.利用-淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖,使淀粉可溶性增加,这个过程称为液化.利用糖化酶将糊精及低聚糖进一步水解转化为葡萄糖,这个过程称为糖化.,（1）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解的反应条件比较温和。（2）微生物作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率高。（3）可在较高淀粉乳浓度下水解。（4）由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富，这就使发酵培养基的组成可加以简化。（5）用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制。,双酶水解法制葡萄糖的优点：,酸酶法:是将淀粉酸水解成糊精及低聚糖，然后再用糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。酶酸法：是将淀粉先用-淀粉酶水解成糊精及低聚糖，然后再用酸将其水解成葡萄糖的工艺。,3.酸酶结合法,二、淀粉的液化1.淀粉液化的方法,在淀粉液化酶-淀粉酶的作用下，使淀粉浆或糊化料水解为含-1，6键的糊精及少量低聚糖的过程。2.淀粉的糊化对于部分流程淀粉在液化之前需经过糊化糊化：淀粉质原料中含有的淀粉是存在于原料的细胞之中，受到细胞壁的保护，在冷水中难以溶解且难以被淀粉酶作用。加热后植物组织细胞膜破裂，淀粉受热吸水膨胀，折叠长链舒展，连结的氢键断裂，淀粉亲水基充分暴露并和大量的水结合，成为凝胶状态，此过程称为糊化。作用的温度为糊化温度。,1.淀粉液化常用的酶-淀粉酶：作用于淀粉分子内的-1，4糖苷键（不能水解-1，6糖苷键），使糖苷键断裂，相对分子质量逐渐变小，依次变为糊精、低聚糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到-淀粉酶的作用后，遇碘呈色很快反应，如下表现：蓝紫红浅红不显色(即碘原色)糊精是若干种分子大于低聚糖的碳水化合物（一般含210葡萄糖单位的为低聚糖）。糊精具有旋光性，还原性，能溶于水，不溶于酒精。与碘作用，聚合度不同颜色不同。,三、双酶水解法制糖（一）液化,葡萄糖聚合度与碘液的呈色表,葡萄糖聚合度与碘液呈色最高吸收波长（nm）78无色48016淡红色51021红色54028红紫色56034紫色兰58041紫色60061兰色620120兰色630330兰色,2.酶法液化方法,连续（喷射）液化法利用喷射器将蒸汽直接喷射至淀粉薄层，以在短时间内达到要求的温度，完成糊化和液化。喷射后，进入保温罐，8590保温45分钟。优点：设备小，便于连续操作，原料利用率高，转化率高，蛋白质凝聚好。缺点：但要求一定压力的蒸汽，进出料的速度要稳定。,喷射液化流程：,调浆(配料)泵喷射泵(一次喷射液化维持罐)二次喷射液化维持罐闪蒸器冷却层流罐薄板换热器糖化工艺控制要点：淀粉乳浓度30%左右pH6.06.5喷射器出口温度（1053）C，层流罐保温97100C，3060min。薄板换热器60CP67双酶法制糖的工艺流程图,谷氨酸二次喷射液化操作工艺,（1）调浆。保持淀粉浓度为17Be，用Na2CO3。调至pH5.07.0，加入耐高温的a-淀粉酶，料液搅拌均匀后用泵把粉浆打人喷射液化器。（2）喷射液化。预热喷射器及层流罐至100，然后进行喷射液化，温度105110维持1530min。（3）高温处理。通过第二只喷射器将料液加热至135140以上，并通过维持罐保持35min、135以上热处理，可达到三个目的：第一灭酶，第二使蛋白质凝固，第三使淀粉分散。（4）真空闪急冷却。经过冷却处理，料液温度从145降至9597。（5）层流罐保温。保温延时。（6)薄板换热器降温至糖化温度。,液化条件与酶反应的影响,液化程度控制液化程度不能低，否则达不到要求影响后糖化效果。还会使糖化液的过滤性相对较差，难于操作；液化过程也不能太高，正常液化条件下，控制淀粉水解程度在葡萄糖值1020之间，此时保持多量的糊精及低聚糖，少量单糖.如果继续液化，虽然最终的水解产物也是葡萄糖和麦芽糖等，但不利于与糖化酶结合结构的形成，影响糖化催化效率。,（二）糖化,1.糖化酶的水解作用（1）糖化：在一定温度下使糊精和低聚糖水解，转化为葡萄糖等可发酵性糖的过程。（2）糖化酶：（也称葡萄糖淀粉酶）对-1，4糖苷键，及-1