HCMV-who国际标准

关于评估首个针对人巨细胞病毒（HCMV）的以核酸扩增（NAT）为基础的世界卫生组织国际标准的协作研究,CollaborativeStudytoEvaluatetheProposed1stWHOInternationalStandardforHumanCytomegalovirus(HCMV)forNucleicAcidAmplification(NAT)-BasedAssays余莉,2020/6/7,研究目的,该协作性研究的目的是通过一系列检测HCMV的NAT试验来确定候选标准品的效力评估候选标准品作为二级参考材料校准的合适性以及标化HCMV的病毒载量检测。,2020/6/7,材料-候选标准品的制备,该候选标准品是由原型的临床HCMV株-Merlin株组成的无细胞游离活病毒制剂。该低传代株拥有良好的HCMV的特征,与实验室其他株相比，近似于完整的HCMV基因组,且已完全测序(Genebank登录号：AY446894)。Merlin株为gB1基因型。考虑到用于HCMV检测样本来源的多样性，候选标准品被溶于通用的缓冲液,该缓冲液含有10mM的Tris-HCl和人血清白蛋白,然后运用正确的样本基质来进一步稀释。最后该制剂经过冷冻干燥以确保长期稳定。,2020/6/7,材料-批量样本的制备,HCMVMerlin毒株的组织上清样本(P4)在MRC-5细胞内增殖，收获传至第六代的组织上清液，培养液先低速离心然后超速离心收获病毒沉淀。病毒沉淀溶于200毫升的含10mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4),包含0.5%的人类血清白蛋白(Tris-HSA缓冲液)中以制成储存病毒液。用于候选标准品和其他样本的人类血清白蛋白为具有生产许可的产品,并经过筛选确保抗-HIV-1,HBsAg,和丙肝病毒RNA均为阴性。制备好的批量样本最终容积为6.4LTris-HSA的缓冲液，HCMV约为1107拷贝/毫升,再使用磁力混合搅拌器搅拌30分钟。取250毫升的批量液体样本分装于2毫升的Sarstedt螺钉帽管内，每等份1毫升，然后存储在-80C。剩下的大部分立即处理成冷冻干燥，是为了准备最终产品,NIBSC代码09/162。,2020/6/7,材料-候选标准品的填充和冷冻干燥,进行填充金属和塑料的GmbH(Radolfzell、德国)负压隔离器冷冻干燥机(CS15012m2,Serail,Arguenteil,France),Bausch&Strobel(Ilfshofen,德国)灌装机FVF5060,2020/6/7,材料-充填后测试,取十二瓶冻干产品评估其剩余水分和氧含量,作为封闭后瓶完整性的指标。剩余水分是由非侵入性的近红外(NIR)光谱(MCT600P,ProcessSensors,Corby,UK)而定的。氧含量测量使用灯塔红外线分析仪(FMS-750,LighthouseInstruments,Charlottesville,USA)。为了在协作研究前确定样本的均质性，取批量液体样本(n=18)和冻干样本(n=18)用HCMVrea-timePCR进行测试。,2020/6/7,材料-冷冻干燥候选样本的稳定性,冷冻干燥的小瓶将温度保持在-70C,-20C,+4C,+20C+37C+45C。从存储的各个温度中取三瓶进行HCMVDNAreal-timePCR(如前所述)。有限的评估重构产品的稳定性。重构产品储存在+4C,+20C+37C,HCMVDNAreal-timePCR在之后的24和48小时进行。,2020/6/7,材料-研究样本的设置,样品1-冻干的09/162制品，装于5mL螺帽玻璃小瓶。样品2-1毫升冷冻的HCMVMerlin株制品(用于制备冻干的候选样本)，装于2毫升的Sarstedt螺帽管。样品3-1毫升冷冻的HCMVAD169全病毒液体，装于2毫升的Sarstedt螺帽管。样品4-50L冷冻的纯化BAC-克隆MerlinDNA，装于0.5毫升的Sarstedt螺帽管。,2020/6/7,研究设计,合作研究的目的是为评估候选的HCMV国际标准在一系列基础NAT试验中的适用性和效能。四瓶研究样本1-4通过快递公司的干冰运输到参与的实验室,按照特定的说明书来存储和重建。,2020/6/7,研究协议,要求参与者在四个不同的场合使用他们常规的基础NAT检测HCMV，检验每个稀释的样本,在分开的独立的实验中使用新的样本瓶。将冻干样品1用1毫升去离子,无核酸酶的水重建，在使用之前至少搅拌20分钟。研究样品1-3在使用前已被解冻,震荡混匀。要求参与者在定量分析的范围内用各自分析中所用的样本基质来稀释样品1-3,提取稀释的每个样本核酸来扩增。要求参与者在无核酸酶的水中稀释样品4,并且取每一个稀释度的等份样本直接用于扩增反应。对于定量分析,要求参与者测试至少两个在线性范围内的连续10倍稀释的实验。要求参与者报告在每个样本不同的稀释度中的病毒载量“拷贝/毫升”(定性分析用正/负表示)，返回结果包括用NIBSC分析的详细方法。,2020/6/7,参与者,研究样本被送到代表14个国家的32个参与者中。参与者是按照他们在CMVNAT上的经验和地理分布上来选择的。他们代表主要临床实验室,还包括一系列的体外诊断设备制造商，以及参考、研究和质量保证实验室。所有参与的实验室被编号,随机分配,而不是按照附录中的清单代表的顺序。,2020/6/7,统计学方法,在定量分析中,分析基于参与者提供的结果。报道的结果为“拷贝/毫升”。对于每一个试验运行,每一个样本获得一个估计的log10“拷贝/毫升”,多个重复样本取其均值“拷贝/毫升”。然后基于不同方法的均数估算值“拷贝/毫升”来计算实验室和试验方法的单个估计值。实验室间(inter-laboratory)的变化用标准差(SD)和%几何变异系数(%GCV)。相对于样本1中不同的效能计算：如果在一个独立的个体上试验,测试样本比候选标准品高0.5log10IU/毫升，候选标准品指定为6.7log10IU/毫升,测试样品的相对效力为7.2log10IU/毫升。相同的方法被用来计算相对于样品4的效能、按顺序评估纯化的DNA使HCMV标准化实验。,2020/6/7,结果和数据分析-研究样本的有效性和稳定性评估,候选样品1的生产数据的显示,质量和填充的变异系数的平均剩余水分是在国际标准可接受范围内的。在NIBSC工作的剩余的氧含量限制是1.1%。在NIBSC评价多个整数(n=18)的研究样本表示,HCMV内容的均质性与之前研究的全部样本相似(每个示例2SD小于0.3log10拷贝/毫升)。,2020/6/7,结果和数据分析-研究样本的有效性和稳定性评估,经过考虑,只有差异+0.204储存8个月的45C样本的统计意义重大。原因还不清楚。所有可用的数据显示足够的稳定性。随后的测试将在12至18个月,然后在2、3、4、5年后进行。,2020/6/7,结果和数据分析-数据接受,数据来自所有的32个参与的实验室。参与者进行各种各样的不同的测定方法,一些实验室执行超过一个分析方法。总的来说,数据集来自53个定量试验,5定性试验。除了下面情况提到的,没有数据的除外。,2020/6/7,结果和数据分析-总结分析方法（1）,大多数的参与者用血浆或全血来稀释研究样品1-3的，然而也有用尿、PBS和无核酸酶水的。稀释的范围在每个实验室之间执行的略有不同。抽取主要是自动化,采用一系列的仪器包括：Abbottm2000sp,QIAGENsQIAsymphonySP和RGQ,BioRobot,MDx和EZ1,bioMrieuxNucliSENSeasyMag,RocheMagNAPureLC和COBASAmpliPrep,SiemensVERSANTkPCR。手工抽提包括：RocheHighPureViralNucleicAcidKit,NanogenEXTRAgen,QIAGENQIAamp(BloodDNA,DNAandViralRNA)MiniKits,QIAGENQIAampDSPVirusKit,CepheidaffigeneDNAExtractionKit以及酚氯仿抽提。,2020/6/7,结果和数据分析-总结分析方法（2）,报告的大多数数据使用的是实时PCR技术，17个参与者使用商业化分析和试剂(37组数据),而13个参与者使用成熟的实验室方法(17组数据)，2个参与者同时使用商业和成熟的实验室方法(4组数据)。检测靶点包含多个HCMV基因：UL122/UL123(MIE/IE19),UL54(DNA聚合酶),UL83(pp65)，UL55(糖蛋白B),US8，HXFL4,UL34和UL80.5。扩增平台包括：RocheLightCycler1.5,2.0and480systems,COBASTaqManandCOBASAMPLICORAnalyzer,AppliedBiosystems7300,7500,7500Fast,and7900HTFastReal-TimePCRSystems,AgilentMx3000PqPCRSystem,QIAGENRotor-GeneQ,Rotor-Gene3000and6000instruments,CepheidSmartCyclerIIandBio-RadMyCycler。考虑到分析组合和变量的范围,事实上没有两个试验是相似的（除了两个实验室使用RocheCOBASAMPLICORCMVMONITORTest),因此不太可能将根据方法分组并且根据方法进行分析。,2020/6/7,结果和数据分析-估计研究样本的效能,实验室对每一个研究样本的定量分析(log10拷贝/毫升)和定性分析(log10NAT检测单位/毫升)的平均估计效能分别见表3，4。各个实验室对每个试验和研究样本的平均估计效能见图1a-d的直方图。每个盒子代表一个实验室的平均估计效能，这个盒子上贴有该实验室的代码编号，来自于定性试验的结果用灰色阴影表示。样品1-3的结果显示，在不同的试验中病毒载量被报道有相当大的变化,估计有相差大于2log10(100倍)(表5)。这些定性试验的估计通常是低于定量分析的。与此同时,样品4的变化性大于样品1-3,虽然这主要是由于从五个不同的试验结果得来的（图1d)。,2020/6/7,图1，单个实验室使用定量或定性的NAT试验所获得的研究样本1-4的平均值。每个盒子代表每个实验室估计的平均值并且贴上实验室代码标签。定性的结果分析用灰色阴影表示。,2020/6/7,2020/6/7,2020/6/7,2020/6/7,结果和数据分析-估计研究样本的效能,表5显示了每个研究样本的总体估计平均值,包括定量和定性试验，以及标准差(log10的估计值)和%GCV(实际的估计值)。对于样品1-3,定量分析的标准差大约是0.5log，%GCV大约是200%。定性分析也是相似的。样品4的标准差和%GCV高于样品1-3,一大部分原因要归咎于是无关的结果。,2020/6/7,结果和数据分析-相对于样本1的效能,对于每一个定性和定量的试验，样品24与样品1的的相对效能单位表示为候选样本的log10国际单位/毫升。当样品2和3的平均估计值表达为相对于样本1时来说,实验室之间的一致性有很大的提高。而定性的结果有更大的可变性。然而,当样品4的平均估计值表达为相对于样本1时，实验室之间的一致性没有明显改善。,2020/6/7,图2，每个定量和定性的试验的样品2-4对比样品1的相对效能。在这两种情况下单位表示为候选样本log10单位/毫升。每一个盒子代表每个实验室测定的相对效能并且贴上该实验室标签的代码。定性分析的结果用灰色阴影表示。,2020/6/7,2020/6/7,2020/6/7,结果和数据分析-相对于样本1的效能,这表明使用样本1作为标准，会显著减少估计与样本2，3相似的临床样本的HCMV浓度的实验室间的差异。与对样品4没有减少定量测定的标准差。样本1需要提取,样本4不需要，对于样本4，实验室之间的萃取效率和方法仍然会导致观察到的实验室之间的变化。,2020/6/7,结果和数据分析-相对于样本4的效能,样品1-3相对于样本4的相对效能,定性和定量结果表明,与图1a-c相比较，当纯化DNA样本4被用于校准标准时，实验室之间的一致性并没有改善。实验室之间的标准差已经从事实上的约0.5log10增加到0.64log10,而%GCVs增加超过300%。这些结果表明,随着提取纯化DNA样本4不是提取于临床样本的,在实验室之间就无法控制不同提取方法和效率。,2020/6/7,图3，以IU表示的相对于样品4的样品13估计浓度，样品4的假设单位量为107国际单位/毫升。每个盒子代表每个实验室的相对效能并且贴上该实验室编号标记。定性结果分析用灰色阴影表示。,2020/6/7,2020/6/7,2020/6/7,实验室内部的变化,表12显示了每一个实验室的实验室内部的标准差和%GCVs，计算时将样本13的估计混合,但样本4是独立计算。对于所有样品,实验室之间变异都大于实验室内部的变化(p0.0001)。对于样本1-3，估计实验室试验的重复性之间有差异，一般说来平均标准差为0.11log10，%GCV为30%。对于样本4，实验室之间有更大范围值的变化,平均标准差为0.21log10而%GCV为63%。,2020/6/7,结论,这项研究的结果表明NIBSC（Natio