脐血干细胞及其应用2011

脐血干细胞及其应用,干细胞相关知识扩展,第一部分,“干细胞”的概念在数十年前就已有介绍，但是直到目前，仍然还无法从形态或表型界定干细胞，而只能根据其功能定义。干细胞具有两种特定的功能。增殖功能指干细胞具有自我更新能力，可以生成更多的干细胞；分化功能则指干细胞能分化成为各种祖细胞，后者可以进一步分化成各种特定成熟细胞系。因此，目前干细胞的最好界定方法是功能学法。,胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)被认为是最多能的干细胞群体，具有最大的发展潜能，对胚胎细胞或组织的利用还存在伦理学争议。成人干细胞。在许多成人组织中已经发现有多种干细胞群体存在，如骨髓中的造血干细胞，以及其他骨髓衍生干细胞(BMSC)能分化为血细胞和多种组织细胞。为了避免潜在的伦理学问题，克服免疫不相容性，在未来的组织工程中自身成人干细胞可能成为理想的选择。脐带血干细胞的特性和用途可能有效地替代骨髓和外周血。对脐带血干细胞的特性和用途正在进一步的探索。,干细胞的分离,体外实验技术以识别干细胞表面标记物作为基础，如CD34、AC133、STRO-1和神经营养素受体p75等已经用于干细胞的纯化实验，包括细胞淘选、荧光激活细胞分类、免疫磁性选择和免疫吸附柱分离等。目前有证据表明，如果利用某种单一的标记物分子进行干细胞分离，而对不表达该标记物的新干细胞群体尚未充分研究，则不能完全肯定分离结果。例如，干细胞活性与CD34分子在细胞膜上的表达不完全相关，小鼠体内存在一大群“静默”干细胞，它们不表达CD34分子但仍具有完整的重建能力。在人体内也发现存在类似的CD34阴性休眠生血干细胞。因此，在未来实验中应设计新的方案，以成熟细胞系的标记物作为细胞转移基础会更有效。,干细胞的扩增,为了克服干细胞数量少的不足，众多学者已经在探索干细胞的体外扩增方法。但是，如何在长期的扩增过程中使干细胞不分化而又保持其多系分化能力成为一大难题。在干细胞临床实际应用中，理论上认为需要一个无基质、无血清的体外系统，并用已知的细胞因子和生长因子维持。白细胞介素-3(IL-3)、干细胞因子(SCF)和Flt-3配体(FL)具有非细胞系特异性的早期生血刺激作用，可用于脐血干细胞的增殖培养。血小板衍生生长因子(PDGF)-BB和表皮生长因子(EGF)是最有效的人类骨髓衍生干细胞克隆生长支持因子。从人类发育中的脑皮层中已成功分离出神经前细胞，并利用表皮生长因子和纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)使其扩增。进一步的研究，如系统性分析生长因子受体的表达，将有助于设计新的干细胞体外扩增培养方案。,干细胞的分化,在干细胞研究中，热点之一是调控细胞向预定群体分化。过去数年间，关于干细胞在体内以及体外分化成各种成熟细胞的报道大批涌现。干细胞最重要的细胞外调控信号之一是生长和分化因子。转化生长因子-(TGF-)家族成员对胚胎干细胞和神经脊干细胞有显著的促分化效应，Wnt家族分子在多种不同的细胞分化中也起着重要作用。但是，由于还无法得到纯化的功能性Wnt蛋白，对于多种Wnt因子的确切效应的更深入研究受到了限制。除了各种分泌因子外，整合膜蛋白和整合素、细胞外基质在干细胞调控微环境中也发挥作用。,细胞因子的特点和作用,细胞产生的具有生物学活性的小分子蛋白质。产生和作用的高效性、多样性、瞬时性。细胞因子的作用通过与细胞表面相应受体结合而起作用。一般培养细胞中细胞因子的使用量为5ng100ng/ml,有量效关系。细胞因子间有协同作用、相加作用、拮抗作用用于细胞增殖的细胞因子造血干细胞：Flt-3ligand,SCF,TPO,IL-3,IL-7,IL-11树突状细胞：GM-CSF,G-CSF,IL-1beta,IL-4,TNFalpha神经干细胞：EGF,FGF-basic间充质干细胞：EGF,PDGF-AA胚胎干细胞：FGF-basic用于细胞分化诱导的细胞因子Activins,BMPs,Cripto-1,Dkk-1,FGF-8,GDFs,Lif,Nodal,Noggin,Notch,Shh,TGFbeta,Wnts,第二部分,脐血干细胞特点与应用,脐带血干细胞,造血干细胞CD133、CD34等+,间充质干细胞CD13、29、44、105等+,SCF、CSF、IL-3,6等可刺激细胞扩增,采用密度梯度离心法和贴壁法分离,采用密度梯度离心法和免疫磁珠法分离,调整培养基偏酸性，1%pen-strep,不同诱导分化条件分化为不同细胞,脐血造血干细胞的含量等于或超过骨髓。造血谱系标记,如CD3、CD14、CD19、CD34、CD45等呈阳性。在体外对脐血祖细胞进行培养,发现使用SCF加G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6等作为刺激因子培养,细胞集落形成增加,脐血中的造血干细胞有更大的潜在分化和增殖能力。从脐血中分离出单核细胞,在体外培养,贴壁细胞形态表现为破骨细胞样细胞和间充质样细胞两种,间充质样细胞表达多种间叶祖细胞(MPCs)的相关抗原(SH-2、SH-3、SH-4、ASMA、MABl470、CDl3、CD29、CD44、CD105)。用含2%和5%较低血清浓度的条件下,脐血单个核细胞可分化成较为均一的间充质样细胞,并可以在数量上扩增的同时,保持其多向分化的潜能，在一定条件下可以诱导分化为神经细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞等。,采用MiniMACS分选系统分离脐血CD34+细胞,其纯度可达到(83.1310.73)%,得率一般为1%。采用新鲜的脐血分离CD34+单个核细胞。一般(25)108脐血单个核细胞能分离出(35)106CD34+细胞。,脐血、成人外周血和骨髓CD34+含量（xS）标本标本数（n）CD34+含量（%）成人骨髓73.191.05*脐血482.141.23*成人外周血480.190.14*骨髓与脐血比较P0.05；*脐血与外周血比较P0.001骨髓与外周血比较P0.05）,脐血和成人外周血淋巴细胞表型及NK细胞活性（xS）脐血成人血CD350.012.473.38.9CD440.112.440.77.1CD813.84.327.05.5CD4/CD83.21.51.60.4CD1616.96.211.96.3NK-A17.812.440.821.6脐血与成人血比较，P0.01。,脐血清与成人外周血清中IL-2、TNF、SIL-2R水平（xS）标本样品数量IL-2（pg/ml）TNF（pg/ml）SIL-2R（pg/ml）脐血404240181.4113.35.510.92214.096.1成人血373537305.2125.47.451.58112.172.5P值0.010.010.01,不同血清培养体系中脐血CFU-GM产率（xS，n=5）刺激因子脐血清脐血清+GM-CSF胎牛血清胎牛血清+GM-CSF集落产率/10.63.837.411.6*012.84.01105细胞*脐血清与胎牛血清比较P0.01脐血清对脐血细胞有体外促增殖作用，而胎牛血清则无此作用，说明脐血清含有促CFU-GM生长的造血活性物质。在培养体系中加入GM-CSF时，集落数都增加，但脐血清组增加显著，说明脐血清中含有与外源性GM-CSF协同因子。,脐血清与成人外周血清中集落刺激活性（CSA）、白细胞介素3（IL-3）、粒巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平,脐血、成人血清中CSA、IL-3、GM-CSF活性比较（xS）血清脐血清（U/ml）外周血清（U/ml）CSA248.30155.974.381.89GM-CSF197.78111.01112.0991.91*IL-3638.3205.966.839.3脐血中含有高水平的CSA，之中以IL-3含量为主，而GM-CSF含量很低。t值12.9，P值0.001,研究方法：1粒系集落计数法2脐血粒巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）微量培养法3MTT法,脐血治疗疾病的显著优点,(1)来源丰富,易于获得;(2)取血时对于母体和婴儿均无痛苦;(3)脐血可以长期储存;(4)发生移植物抗宿主病的发生率低;HLA-DR、CD80、CD86阴性表达;其中,HLA-DR位点是异基因移植时免疫排异反应发生的主要位点;CD80和CD86是移植物抗宿主病(GVHD)发生的最重要共刺激通路B7/CD28的信号分子。(5)脐血中含各种原始细胞如造血干细胞、间充质干细胞,具有较强的增殖分化的能力;(6)脐血中各种病毒感染的几率相对较少。近年来,脐血由于其独特的生物学特点,储存数量及进行脐血治疗的患者日益增多。,SCF/CSF/IL-3等刺激细胞扩增bFGF/EGF/NGF/IGF等促进细胞定向分化,CD34+细胞向神经元样细胞的分化,多种细胞因子的组合会更好。但细胞因子和细胞因子之间存在协同作用、拮抗作用、叠加作用等,IL-3能促进G0期造血干细胞（静默干细胞）进入细胞增殖周期，IL-6可协同IL-3支持多能干细胞分化增殖。,MSCs向神经元样细胞的分化,脐血单个核细胞106/cm2接种于MesencultTM培养液(StemCell公司)中,调整培养基偏酸性，1%pen-strep，37、5%CO2培养。1周后,更换培养基,弃掉未贴壁细胞。以后每3d换液1次。细胞长到80%融合时,用11的2.5g/L的胰蛋白酶和0.2g/LEDTA混合液消化(在显微镜下控制消化时间),以8.0103/cm2的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养。,定向诱导MSCs向神经元样细胞分化：取传至第3代的MSCs按4105/L密度接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，用含有1mmol/L-巯基乙醇的DMEM（20FCS）预诱导24h，PBS洗涤3遍后，换成含10g/L二甲基亚砜和100mmol/L丁化羟基苯甲醚的无血清DMEM进行诱导，每隔30分钟在倒置相差显微镜观察细胞型态变化。,贴壁细胞以间充质细胞为主，同时有大量破骨样细胞,传代后，破骨样细胞减少，逐渐形成MSCs,传代1-2周后，MSCs融合，增殖能力强,干细胞与血管新生,心血管、脑血管、外周血管等缺血性病变引起多种临床疾病，如冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脉管炎、股骨头坏死、糖尿病足等.10几年前人们已开始血管再生的试验研究和临床应用。如将VEGF质粒直接注入闭塞的外周动脉,4周后血管造影显示侧支血管增加,多普勒超声检查示血流量增加80%,外周动脉闭塞的间歇性跛行和冠心病应用中有明显疗效。近年,内皮前体细胞(EPC)与血管新生的关系及在治疗性血管新生中的作用受到特别的注意。,成年后EPC主要分布于骨髓,外周血液中也有少量EPC,约为24EPC/ml,在急性心肌梗死时为1040EPC/ml,脐带血中可达10004000EPC/ml,其特异的细胞表面标志为CD34+、Flk21+与AC133+。VEGF是EPC的增殖与分化的必需诱导因子,GM-CSF也促进EPC的增生与分化,而血管抑制素(angiostatin)起抑制作用。此外,他汀类药物可将EPC从骨髓动员至外周血并增加其功能与活性。动物实验：1）给后肢缺血的裸鼠注入人脐血EPC能显著增加局部血流量与微血管密度。2）给心肌梗死的裸鼠静脉注射EPC可促进新血管的形成,并减少缺血心肌细胞的凋亡。3）年幼(3月)小鼠骨髓EPC能促进老年(18月)小鼠的心肌血管增生与心脏功能改善。4）将VEGF基因转染至EPC,使后者具有更高的增殖活性与功能,动物实验已证实,转染有VEGF的EPC增加细胞的增殖与参与血管形成,促进缺血心肌与肢体的血管新生,达到改善功能与保护肢体的目的。,血管新生是当前医学与生物学研究的热点,治疗性血管新生在心脏血管与外周血管狭窄的动物实验中有很好的效果,并且已在数百例心与外周动脉缺血患者进行了临床一、二期试验治疗,取得了一定的成绩。但由于对人有效灌注所需的管腔面积要比实验动物大得多,因此取得理想治疗效果要困难得多。一些重要的问题尚待进一步解决:确定合适的剂量以及更合理地联合运用多种诱导因子?延长转染的基因在体内的表达时间?是否有使机体其他部位不该增生的血管增生的危险?治疗性血管新生为心与外周血管疾病的防治开辟了一个新的途径,并可能特别适用于那些不能用药物、介入和/或手术治疗,或治疗效果不好的患者。此外,这种新的治疗方法也可促进创伤愈合与手术伤口愈合,将有广泛的应用前景。,促血管新生因子,血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮细胞专一性丝裂原和血管新生强烈的刺激因子。内皮细胞表面的两个酪氨酸激酶受体Flt-1与Flt-1/KDR与VEGF结合后,传导相应的增殖与迁移信号,使内皮细胞增殖,形成新的毛细血管并重构与稳定。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其受体FGR2,血管生长素1(Ang-1)及其受体Tie-1与Tie-2,胎盘生长因子(PlGF),肝细胞生长因子(HGF),血管生成素(angiogenin)、血小板衍生生长因子(PDGF)与环氧化酶-2也是重要的促血管新生因子。这些因子相互协同,并且在细胞分化的不同阶段发挥不同的作用。VEGF在血管新生的起始与维持阶段都有作用,bFGF主要参与初期过程,而Ang-1、PlGF与PDGF主要影响血管的成熟与稳定。,脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化,Ficoll密度梯度离心法得脐血单个核细胞MACS法脐血CD34+单个核细胞分离细胞培养:将分离所得CD34+和CD34-单个核细胞分别接种于60mm培养皿中,加入M-199培养基,20%FCS、牛脑提取物作为内皮细胞生长补充,抗生素、生长因子VEGF30ng和bFGF24ng,于37,5%CO2饱和湿度的孵箱中培养。培养3、7、14d,显微镜下观察细胞形态和细胞簇形成的情况。,试验中细胞的诱导分化主要采用生长因子为VEGF和bFGF。bFGF可引起内皮细胞的增生和移行,且还可以与VEGF协同作用,在体外促使内皮细胞分裂成毛细血管样结构,在体内产生血管新生。VEGF是血管内皮细胞的有丝分裂原，还能抑制CD34+前驱细胞中树突状细胞的成熟。VEGF和bFGF的组合在体外明显促进内皮系细胞的生长和分化,内皮系细胞具有优势性地生长。,细胞形态学观察,刚分离的CD34+和CD34-单个核细胞呈圆形,细胞形态小,不均匀地悬浮分布于培养皿底部,CD34+细胞培养48h后可见细胞贴壁,3d后有明显集落形成,7d后大量梭形细胞从细胞簇周围开始生长。梭形的细胞出现典型的线样排列结构,相邻的细胞簇之间相互连接形成血管网样结构,CD34-单个核细胞单独培养,可见部分贴壁细胞,大部分细胞呈悬浮状,且贴壁细胞主要为圆形,随着培养时间的增加细胞形态逐渐变大,呈现出不规则形态,内皮特异性成分蛋白水平的鉴定CD34+细胞培养14d后在细胞膜和细胞浆中都有弥漫性棕色出现,呈现出阳性反应。证实了有内皮细胞特异性成分ecNOS和flk21(KDR)蛋白水平的表达,脐血分离的CD34+细胞培养前后祖细胞标志物CD34+随着细胞的成熟表达水平下降,而内皮细胞的标志物CD31明显升高(P0.05)。说明祖细胞诱导培养后的贴壁细胞具有内皮型标志物。,PE-CD34抗体(鼠抗人)和同型对照鼠IgG1抗体(Diaclone);FITC-CD31抗体(鼠抗人)和同型对照鼠IgG1抗体,脐血,纤连蛋白用PBS溶解稀释为1ng/l后包被24孔板,372h,临用前吸出多余的液体,PBS洗两次。分离的CD133+细胞按(12)105/cm2接种于包被好的24孔板中。每孔中加入M199培养液1ml,添加10%胎牛血清,1%青链霉素(1万单位/ml),VEGF50ng/ml,b-FGF1ng/ml、IGF-12ng/ml,5%CO2的37孵箱中培养,每4d换液一次。,诱导分化,MACS磁珠分选出CD133+细胞,血管内皮细胞鉴定,分离出单个核细胞,为进一步确定梭形细胞是否为内皮细胞,培养14d左右,消化贴壁细胞,用内皮细胞特异性抗体CD144、KDR、vWF、UEA-1标记,流式细胞仪分析,脐血CD34+细胞体外定向诱导分化为T淋巴细胞的实验研究,体外已经证明造血干/祖细胞可向髓系、红系、巨核系、B淋巴系、NK细胞和DC细胞分化,但是由于需要胸腺组织的参与,体外T淋巴细胞的产生更加困难。由于脐血来源丰富、容易收集,所以作为干细胞来源已越来越受人们重视。成熟的T细胞具有重要的移植免疫和肿瘤免疫效应,并且对艾滋病的治疗起重要作用。,胎儿胸腺基质单层细胞培养,水囊引产1824周胎儿。无菌操作取出胎儿胸腺组织,洗涤后剪成大小约1mm3碎块。将胸腺组织碎块移入24孔板中,每孔56块,加入含20%AB型人血清及1mmol/L谷氨酰胺的IMDM(含有庆大霉素50g/ml)培养液,于375%CO2孵箱中培养。胸腺基质细胞贴壁后每34天换液1次,逐渐去除非贴壁细胞。当胸腺基质细胞60%80%融合后接种CD34+细胞。,CD34+细胞的分选,脐血采集量为80100ml,标本在4小时内分选。将收集的脐血用6%羟乙基淀粉去除红细胞,比例为31,离心去除血浆后用淋巴细胞分离液(密度11007mg/ml)密度梯度离心分离出单个核细胞。用吸附单克隆抗体2磁珠分离系统(MACS,MiltenyiBiotec)进行CD34+细胞分离,用上述培养的胸腺基质细胞作为滋养层,24孔培养板,每孔加入CD34+细胞约5104,并且加入细胞因子IL-1210ng/ml、FL100ng/ml、IL-76ng/ml及IL-215U/ml。为了刺激T细胞增殖,45周后的细胞只加入IL-230U/ml及PHA3g/ml培养12周。,T细胞的诱导分化,结果观察,采用免疫磁珠的方法分选CD34+,获得CD34+细胞量3.51051.26106。流式细胞仪检测CD34+CD38+细胞占细胞总数的85.2%90.4%,CD34+细胞纯度85%98%实验组中接种到胸腺基质单层细胞上的细胞成倍扩增(1014倍)实验组中第7天检测CD3、CD4、CD8表达,CD4+CD8+双阳性细胞占11.7%,第14天检测CD4+CD8+双阳性细胞占013.3%,第28天检测CD4+CD8+双阳性细胞占16.6%24.8%,第35天检测CD4+CD8+双阳性细胞占16.6%26.5%。第2835天后检测CD4+CD8-双阳性细胞的比例逐渐下降,而CD4CD8单阳性细胞的比例却逐渐提高,6周后CD3+CD4-CD8+单阳性细胞达26.5%64.9%、CD3+CD4-CD8+单阳性细胞达11.6%38.9%,结果分析和意义,脐血间充质干细胞诱导分化为肝细胞,细胞的分化和再生受到生长因子或细胞因子的调控,在肝细胞的再生过程中起促进作用的细胞因子包括:肝细胞生长因子(HGF，Heapacytegrowthfactor)、纤维细胞生长因子(FGF)、致瘤素M(OSM)、转化生长因子(TGF)、白介素-6(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素、去甲肾上腺素、加压素、儿茶酚胺、干扰素等。体外实验证实,在适宜的诱导条件下,脐血间充质干细胞能够分化为肝细胞。脐血间充质干细胞诱导为肝细胞,常用的诱导因子有HGF、FGF、OSM、TGF等,多种细胞因子联合应用的诱导效果更好。HGF正常肝细胞的最强有丝分裂剂，有文献显示还能促进神经干细胞向神经元细胞定向分化（10ng,50ng,100ng/ml)。FGF促进肝细胞有丝分裂，在肝再生和发育中有重要作用检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白、角蛋白18(CK-18)、角蛋白19(CK-19)、糖原的合成、尿素的分泌以及低密度脂蛋白的摄取等,以了解已分化的细胞是否具有肝细胞的某些功能。,实验方法：脐血有核细胞用含15%胎牛血清的DMEM培养基进行培养加入FGF-1(重组人纤维细胞生长因子1)、FGF-2(重组人纤维细胞生长因子2)、LIF(重组人白血病抑制因子)、SCF(重组人干细胞因子)、HGF(重组人肝细胞生长因子)、OSM(重组人抑瘤素M)诱导7天、14天、21天检测肝细胞特异性标志ALBmRNA,CK18、CK19、CS。,脐血干细胞向树突状细胞的诱导分化及其exosomes的提取,常规密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞,静置1h，分别获得贴壁细胞和悬浮细胞,经GM-CSF/IL-4/SCF诱导培养9d,分别加入反复冻融的肿瘤裂解抗原、肿瘤细胞总RNA及富含胞嘧啶鸟嘌呤的寡脱氧核苷酸序列（CpGODN），继续培养2d,收集细胞进行形态学表面标志鉴定,经尼龙毛柱分离获得T细胞,加入IL-2培养扩增，,收集培养上清，依次经低速离心、高速离心去除细胞、细胞碎片和大分子蛋白,将上清经超速离心，获得沉淀即为exosomes,紫外荧光分光光度计进行定量,透射电子显微镜放大4万倍观察其结构和形态,SDS-PAGE观察蛋白带型,Westernblot鉴定蛋白成分,T细胞增殖试验CTL杀伤活性荷瘤裸鼠体内抗肿瘤试验,脐带血,图A培养10dUBMC衍生的DC在倒置显微镜下形态(400),细胞出现典型绒毛样或毛刺样突起,图1CHE染色UBDCs形态(1000)DC胞浆丰富，核偏位，不规则，染色质浓染且不均匀，呈斑块状，有遍布周边的微绒毛样毛刺。,图1B扫描电镜下成熟UBDCs形态（3500）细胞突起呈树根样、幕样或绒毛样,诱导成熟前后脐血DC表面标志的表达,bP0.01vsbeforeinductiongroup.aP0.05vslytic-Aginductiongroup.,表1脐血MC衍生的DC诱导前后细胞表面标志的表达（n=10，xs，%）,PhenotypeBeforeinductionlytic-AginductionRNAtransfection,MHC-I6.922.0344.6711.39b65.235.11baMHC-II8.604.6156.247.33b70.624.33baCD11c1.990.7648.994.96b57.023.91bCD541.881.2144.215.56b68.196.25baCD801.352.3244.715.35b63.664.72baCD865.471.7338.561.23b66.195.13ba,CD402.772.1646.774.50b70.116.30ba,第三部分,制备中的注意事项（质量控制）,1、安全、无污染2、有效临床疗效是检验有效的重要标准。从试验室层面上讲应做到：1)活细胞数量：106108越多越好；2)细胞种类：干细胞、祖细胞、前体细胞、成熟细胞；FACS3)细胞活性：增殖分化能力旺盛。,1.细胞克隆形成率实验：单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。克隆形成率比克隆形成数接种细胞数缺点：操作繁琐优点：精确、可靠2.台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。3.四唑盐（MTT）比色法四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值.MTT法简单快速、准确。,污染的类型,一、细菌污染最常见的是革兰氏阳性葡萄球菌以及革兰阴性大肠杆菌。细菌污染后，培养液变混浊，pH改变。也有时只能在镜下发现菌体才知污染。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后细胞死亡。,二、真菌污染最常见的真菌有霉菌、白色念珠菌和酵母菌。真菌污染后，培养液中漂浮有白色或浅黄色的颗粒，有的散在生长；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。,三、支原体污染支原体能独立生活的最小微生物，最小直径0.2m，光镜下难以看清它的形态结构。不易发现。受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。,四、病毒污染和其它细胞污染五、物理、化学物质的污染,1、细菌、真菌污染的检测（1）肉眼观察污染常在开放性操作之后发生，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。（2）镜下观察在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。（3）接种观察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。2、支原体污染的检测（1）荧光染色法观察用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。（2）电镜检测（3）培养检测培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。(4)PCR检测,污染的鉴别,PCR法测细胞培养的支原体污染原理：利用特殊专一性的引物，经PCR反应来复制支原体DNA。所用的引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列，由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同，因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定。特点：灵敏及快速，可检测到不易培养的支原体，不必培养支原体作阴阳性对照，避免可能带来的污染。缺点：PCR反应很灵敏，