盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质.ppt

盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质一、实验目的1学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。2掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。3比较醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质的效果。,二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)又称为共聚体的N，N一甲叉双丙烯酰胺(methylemebisacrylamide，简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。由于这种凝胶具有分子筛的性质，所以对样品的分离作用不仅决定于样品的各组分所带的电荷的多少，而且也与分子的大小有关。其次，此凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，因而较醋酸纤维薄膜电泳，琼脂糖电泳等具有更高的分辨率。,在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好，化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，几乎无电渗作用，样品不易扩散，用量少(1100g)等优点。聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可以测定分子量、等电点等。,(一)聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate，(NH4)2S2O8简称AP)或核黄素(ribofavin，即vitaminB2，C17H20O6N4)和加速剂N，N，N，N一四甲基乙二胺(N，N，N，N一tetramethylethytenediamine，简称TEMED)的作用下，聚合而成的三维网状结构。催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有2种催化体系。1.APTEMED化学聚合作用TEMED是一种脂肪族叔胺，其碱基可催化AP水溶液产生出游离氧原子，然后激活Acr单体形成单体长链，在Bis作用下聚合成凝胶。,2核黄素一TEMED光聚合作用TEMED可加速凝胶的聚合，但不加也可聚合。光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量氧会阻止链长的增加，因此应避免过量氧的存在。用核黄素进行光聚合的优点是：核黄素用量少(1mg100m1)，不会引起酶的钝化或蛋白质生物活性的丧失；通过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备浓缩胶(大孔胶)较合适。,聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamidegelelectrophoresis简称PAGE)根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者在电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH值、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。目前常用的多为垂直的圆盘及板状两种。,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成，它们在直立的玻璃管中(或2层玻璃板中)排列顺序依次为上层浓缩胶(大孔胶)、下层分离胶(小孔胶)。浓缩胶是核黄素催化聚合而成的大孔胶，分离胶是由AP催化聚而成的小孔胶，T=7O75，C=2.5。凝胶缓冲液为pH8.9TrisHCl，大部分血清中各种蛋白质在此pH条件下，按各自负电荷量及相对分子质量泳动，此胶主要起分子筛作用。,浓缩效应：由于缓冲体系中pH值选择不一(浓缩胶缓冲液pH67，电极缓冲液pH83)导致HCl中Cl-几乎全部解离，甘氨酸中仅O.1l解离为NH2CH2COO-，而蛋白质在这种酸碱度中也解离为蛋白质一COO-。这三种带负电荷的离子在电泳时，同时向正极泳动，但泳动率不同。Cl-离子泳动最快而居先，称“前导离子”(1eadingion)，NH2CH2COO-离子最慢而殿后，称“尾随离子”(trailingion)。这样，在快离子的后面形成一条离子浓度低的低电导区，从而产生较高的电压梯度而加速了蛋白质的泳动。又因蛋白质的泳动率介于快慢离子之间得以被浓缩为一条狭窄的盘形带。,电荷效应：蛋白质在界面上被高度浓缩后，虽形成一条狭带，但因其中每一组分所带荷电量不一，因而泳动率也有差异，这就使其各组分按一定顺序形成若干圆盘。分子筛效应：当蛋白质夹在快慢离子间通过隔层进入分离胶时，尾随离子由于凝胶的pH值与孔径的突变导致进一步解离而增速以至超过蛋白的泳动率，使高电区梯度不复存在。然而蛋白质在这种均一的电压梯度的条件下，因其各组分的相对分子质量或构型不同，在通过一定孔径的凝胶时，必然受阻程度不同。这种分子筛效应，使之泳动率仍有差异而得以分离。,本实验采用垂直管型分析盘状电泳。凝胶柱用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在垂直的玻璃小管中聚合而成。蛋白样品液放在凝胶柱顶端。整个系统用多相(不连续)缓冲液。当电场通过垂直的凝胶柱时，样品成分就根据它所带的电荷、分子的大小、形状，以特定的泳动率迁移分离成带(盘状)。电泳后，取出凝胶柱作固定和染色处理，显示特定蛋白质的位置。,三、操作步骤1.准备工作2.分离胶（小孔胶）的制备在干净的50ml小烧杯中，分别加入液1ml；液2ml，蒸馏水1ml；液4ml，轻轻摇匀。然后用长滴管吸取此液加入玻璃管中，沿玻管壁缓缓注入蒸馏水，水层35mm高，加蒸馏水的目的是防止空气中的氧妨碍凝胶的形成，以及消除液柱表面的弯月面。,3浓缩胶(大孔胶)的制备在小烧杯中，分别加入液1ml，液2ml，蒸馏水1ml，液4ml，轻轻摇匀，然后放在暗处。将已制成分离胶的玻管倒立于滤纸上除去水，再用滤纸条吸去残留的水，注意不要碰到胶面。用滴管吸少量的浓缩胶液洗一下凝胶顶。然后把此凝胶管垂直插在一个支架上(这个支架可用一块木板，上面钉两个钉子，长钉之间套两道橡皮筋制成)，用滴管加上述浓缩胶1.0cm高，上面加水层，操作同分离胶制备。把以上固定在木板上的凝胶管移至日光灯下(距管lOcm高)照射，进行光聚合。开始显淡黄色，56min后逐渐转乳白色，表明聚合开始，继续光照2030min，使聚合完全。,4.加样倒去凝胶上覆盖的水层，并用滤纸条吸去沾在管壁上的水，再用电极缓冲液洗涤一下胶顶，然后轻轻去除下端胶布，再用电极缓冲液洗去蔗糖液。把凝胶管插到电泳槽的橡皮圈内，注意垂直。电泳槽的下槽先灌注电极缓冲液(注意把母液稀释10倍)约200ml，再把上槽安置到下槽上，注意凝胶管下端不要有气泡，如有气泡用玻棒轻轻敲玻管即可驱除气泡。用1ml注射器吸50ul样品液（含0.1溴酚蓝指示剂），沿管壁加到浓缩胶顶上，加样针头离胶顶1mm处，勿碰到胶面。然后用滴管沿管壁加电极缓冲液至管顶。最后，在上极槽中倒入电极缓冲液约150ml。,5电泳电泳槽上槽接负极、下槽连正极，然后通电。先恒流：开始用12mA管，电泳30min后调至恒压，电压为290300V(即50V管)。电泳过程中要保持电压稳定，否则电压过高会造成发热，使分离失败。通电25h左右，待溴酚蓝指示液离管底1cm处停止电泳，取出凝胶管。6剥胶用一长针头注射器吸满水，将针头插入凝胶与管壁之间，慢慢旋转玻管，一边压入水，一边使针头慢慢呈螺旋式地前进，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，最后用吸耳球在玻管一端轻轻加压，或用针轻轻压凝胶条，使其滑在干净的烧杯中。剥胶时注意不要损伤凝胶表面。,7染色、漂洗烧杯中加人氨基黑染色液，在90水浴中加热约5min。先用蒸馏水漂洗去胶条表面的染色液，然后再在烧杯中倒入7%醋酸漂洗液，经常更换漂洗液，漂洗23天直至背景颜色去除为止。漂洗净的胶条可放入装有7%醋