第四章 核酸操作的基本原理.ppt

,第四章核酸操作的基本技术,第一节核酸的提取与纯化,制取核酸样品的根本要求是保持核酸的完整性,防止核酸酶对核酸的降解、变性或破坏,一、DNA提取的基本原理与方法,（一）DNA提取的基本原理DNA是极性化合物，溶于水不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂DNA多以脱氧核蛋白（DNP)形式存在提取DNA时用先将DNP抽提出来，在将DNA分离出来,（二）基本步骤,破碎细胞并对DNA快速实施保护,破壁：变性:复性:,将核酸从其它大分子中分离出来,使核酸和蛋白质的复合体解离,1.液氮研磨2.快速加入提取缓冲液,1.离子变性剂、去污剂2.酚、氯仿,1.无水乙醇2.异戊醇,（二）、DNA提取的几种方法,浓盐法SDS法CTAB法苯酚抽提法水抽提法,1.浓盐法,1MNacl,DNP粘液,辛醇+氯仿,乳化,保留水相,核酸,离心,乙醇,破碎细胞,2.SDS（十二烷基硫酸钠）法,SDS,55-65裂解细胞,离心,提高盐浓度降低温度,沉淀蛋白质及多糖,核酸,上清液,乙醇沉淀,释放核酸,3.CTAB（十二烷基三乙基溴化铵）法,CTAB,溶解细胞膜,与核酸形成复合物,低盐溶液,高盐溶液,溶解,沉淀溶于高盐溶液,核酸,沉淀,离心,乙醇沉淀,4.苯酚抽提法,蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，合并含DNA的水相，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态,5.水抽提法,利用核酸溶解于水的性质,用低盐溶液除去RNA此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.,（三）核外DNA的提取,核外DNA包括：质粒DNA线粒体DNA叶绿体DNA,碱裂解法煮沸法去污剂裂解法,先分离完整的细胞器提取纯化原理与质粒DNA相同。,二、RNA提取的基本原理与方法,（一）总RNA提取的基本原理与方法1.总RNA提取的基本原理RNA分离的关键因素是尽量减少RNA酶(RNase)的污染造成RNase酶污的主要来源有:所用的器皿、所用的溶液、实验人员的手及飞沫,玻璃器皿：烘箱中(180)烘烤8h以上,塑料器皿：0.1%DEPC(diethylpyrocarbonate,二乙基焦碳酸盐)浸泡或用氯仿洗涤;配置的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37处理12h以上,然后高压灭菌;全部实验过程均需戴手套操作,并经常更换;RNA电泳槽常用去污剂洗涤,0.1%DEPC处理,2.总RNA提取的方法异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法盐酸胍-有机溶剂法氯化锂-尿素法,（二）mRNA的提取,一般有两条途径：其一是先提取细胞总RNA,然后再从中分离带poly(A)的mRNA;其二是先提取多聚核糖体,再将蛋白质与mRNA分开。,三、核酸的检测,紫外分光光度法琼脂糖凝胶电泳法,1.紫外光度法原理：DNA或RNA分子在260nm处有特异吸收峰，吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。,方法：首先用TE或ddH2O稀释待测DNA样品用TE或ddH2O为空白对照，在260nm及280nm处调节紫外分光光度计读数为0加入DNA稀释液与上述两波长处读取OD值。,浓度计算（单位：g/ml)双链DNA（dsDNA）=50OD260稀释倍数RNA(ssRNA)浓度=40OD260稀释倍数单连DNAssDNA=33OD260稀释倍数,纯度检测可通过OD260/OD280来衡量OD260/OD280为1.8左右为好1.8为RNA污染，1.8为蛋白质污染,2.琼脂糖凝胶电泳法,核酸分子是多聚阴离子,在电场中向正电极的方向迁移在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。,原理：DNA与溴化乙锭（EB）形成的络合物在紫外光照射下能发射荧光，荧光的强度与DNA的含量成正比。因此可十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA。,根据谱带的形状可反应DNA的质量,同时,通过同已知分子质量的标准DNA片段之间的比较,还可测定出随迁移的DNA片段的分子质量。,四核酸的保存,(一)、影响核酸保存的关键因素关键的因素是保存液的酸碱度和保存温度。1.保存液的酸碱度水、过酸过碱可以断裂核酸的氢键2.保存温度温度升高会降低核酸的稳定性,所以核酸一般都是低温保存。,(二)、核酸制品的保存方法,保存条件溶液：TE(tris-HclEDTApH8.0)ddH2O温度：-70一年以上-20半年左右4数月内,第二节凝胶电泳技术,核酸分子是多聚阴离子，在电场中向正极的方向迁移在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型,一、电泳的原理,基质：常熔点琼脂糖低熔点琼脂糖分辨能力：0.2-50kb凝胶浓度越大，分辨能力越强,1琼脂糖凝胶电泳（agrosegelelectrophisis）,2.琼脂糖电泳的影响因素,1、DNA的分子大小:迁移速率与DNA分子量对数成反比2、琼脂糖浓度迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。10kb胶浓度为0.3-0.7%,两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。,3、DNA分子的构象SCOL,L4、电源电压在低电压(5v/cm)时,迁移速率与电压成正比5、嵌入染料溴化乙啶使线状DNA迁移率降低15。6、离子强度影响pH影响DNA分子所带的电荷(TAETBE),二、琼脂糖变性胶电泳,未变性的RNA，电泳时与电泳迁移率没有严格的相关性在变性条件下电泳，才能使RNA移动距离与其相对分子量对数成正比。RNA变性剂有二种，乙二醛-二甲基亚砜（DMSO）甲醛,三.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,PAGE为垂直板凝胶电泳,基质：由丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺双体聚合分辨能力：其分辨力为为1bp-4kb范围之间的DNA片段凝胶浓度越大，分辨能力越强,四、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）,在琼脂糖凝胶上外加正交的交变脉冲电场,大分子的DNA需调整其涌动方向,DNA分子越大重排所需时间就越长可分离50Kb-Mb(107bp)级的DNA,五、凝胶电泳的检测,琼脂糖凝胶用EBGelRedGelGreen聚丙烯酰胺凝胶用硝酸银同位素,第三节核酸分子杂交,一、核酸分子杂交1.原理：双链DNA或具有二级结构的RNA变性后，具有互补序列的两条单链的退火复性过程若退火的核酸来自不同的生物有机体，则称形成的双链分子就叫做杂合分子。,一、标记的探针,探针(probe)是指带有标记的检测特定的基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列。,（一）探针的制备,1.均匀标记在进行探针标记是掺入标记核苷酸（如-32pdATP)从而使整个分子被均匀地标记切口平移法标记随机引物标记PCR扩增标记,2.末端标记发将放射性或非放射活性化学基团连接到多聚体末端的技术多在5端进行,a,b,c,d,e,3,切口平移法制备标记的DNA分子杂交探针,二、萨瑟恩DNA印迹杂交（Southernblotting）,1.定义根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计,基本步骤,样品制备,标记,膜的制备,DNA杂交,放射自显影,探针,SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.）的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl（AC）、BamH（DF）、EcoR(GI)和Hind（JL）消化，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列，相应的分子大小以kb为单位示于图的右侧）,三、诺塞恩RNA印迹杂交,1.