(4[1].20终稿更正)抗金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体的特性与中和保护作用

学校代码：10610学 号：S063678四 川 大 学硕 士 学 位 论 文抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用Characteristics and Neutralization Effects of Monoclonal Antibodies Against Staphylococcal Enterotoxin B论文题目_抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的制备及其中和作用 作 者_康延申 康延申 _学科专业_细胞生物学 _ 细胞生物学 指导教师_ 郭亚军 教授 魏于全 教授 郭亚军_教授_ 2009 年 04 月 2015 日声声 明明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 申请人：指导教师：目目 录录中文摘要4ABSTRACT5缩略词表6前言7第一章 单克隆抗体的制备10一、 材料与方法10二、 结 果16三、 讨 论19四、 小 结20第二章 单克隆抗体的体外实验22一、材料与方法22二、结果24三、讨论27四、小结28第三章 单克隆抗体的体内试验29一、材料与方法29二、结果30三、讨论33四、小结33第四章 SEB 抗原表位的筛选与鉴定 34一、材料与方法34二、结 果41三、讨论46四、小结47第五章 双功能抗体的制备及体内外实验49一、材料与方法49二、结果54三、讨论58四、小结59全文小结60主要参考文献62文献综述 金黄色葡萄球菌肠毒素 B 研究进展65其他72致谢73摘要11ABSTRACT22缩略词表33前言44第一部分 小鼠抗 SEB 单克隆抗体的制备 77一、 材料与方法77二、 结 果1313三、 讨 论1717四、 小 结1818第二部分 抗 SEB 单克隆抗体的体内外中和保护试验 1919一、材料与方法1919二、结果2222三、讨论2828四、小结2929第三部分 抗 SEB 识别表位的筛选与鉴定 3030一、材料与方法3030二、结 果3737三、讨论4242四、小结4545第四部分 双功能抗体的制备及体内外中和保护作用4646一、材料与方法4646二、结果5151三、讨论5656四、小结5757全文小结5858参考文献6060综述 金黄色葡萄球菌肠毒素 B 研究进展6363其他7070致谢7171抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用7四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文8中文中文摘摘 要要金黄色葡萄球菌肠毒素 B（(SEBSEB）)属于热毒素超抗原家族（(SAgs）)。SAgsSEB 可通过激活 T 细胞，使 T 细胞大量过量增殖并释放大量炎症细胞因子，从而导致中毒性休克综合症及死亡。寻找针对治疗抗 SEB 被动免疫治疗的研究是目前研究的一个热点 SEB 引起引发疾病的治疗免疫学方法手段非常必要。本研究论文中我们制备了 410 株小鼠了抗 SEBSEB 的单克隆抗体并鉴定了抗体的其理化性质， 。4 株抗体的并对 4 株抗体进行了体内外中和保护实验活性。通过噬菌体展示肽段技术鉴定初 4 株抗体的抗原表位。我们制备了有中和活性的抗SEB 的抗体。BIAcore 表面等离子共振(SPR)结果显示 4 株抗体与 SEBSEB 间有相似的亲和力常数。体内外实验结果分析发现得出发现 4A3， ，3C1 和 3E2 抗体的中和效果强于 1A5 抗体。此外还通过噬菌体展示随机肽库技术鉴定了它们的抗原表位。表位筛选图谱分析结果显示提示 4A3 和 3C1 的识别表位定位与 SEBSEB上与 TCR 的结合位点区域内；3E2 抗体的识别表位定位于 SEBSEB 上与 MHC分子的结合位点区域内；而 1A5 抗体的表位定位在 MHC分子结合位点区域附近。最后我们构建通过偶联单克隆抗体 3C1 和-3E2，制备了同时识别 SEBSEB 表面TCR 和 MHC的双功能抗体 3C1-3E2，并证实观察 3C1-3E2 双功能抗体在体内外具有的功能协同中和作用。实验结果显示 3C1-3E2 双功能抗体中和 SEBSEB 的作用效果强于单独使用单克隆抗体单独使用。我们推测：因此，如果两个把两个具有识别不同功能表位的单克隆抗体，融和到一起形成双功能单克隆抗体蛋白，能够同时阻断 SEBSEB 与 TCR 和 MHC的结合，潜在的中和 SEB 的效果的会跟好将具有更有效的中和保护活性， 。抗可能 SEB 双功能抗体有潜力可以成作为一种新颖的免疫学治疗方法候选策略。抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用9ABSTRACTStaphylococcal enterotoxin B (SEBSEB) belongs to a family of pyrogenic toxin superantigens (SAgs) which activate T-cells proliferation and massive release of inflammatory cytokines, leading to toxic shock syndrome and death. It is an urgent need for the development of a passive immunotherapy against SEBSEB. Ten clones of MAbs against SEBSEB were prepared and characterized in this investigation. The neutralization effects of four MAbs were evaluated in vitro and in vivo. Four among these ten clones were evaluated for their neutralization effects in vitro and in vivo, and their affinity for SEB.Epitopes of MAbs were identified by phage display technology. Surface plasmon resonance (SPR)Biacore sensorgrams indicated that 4A3, 3C1, 3E2 and 1A5four MAbs had similar affinities for SEBSEB. In vitro and in vivo assays showed that the neutralization abilities of 4A3, 3C1 and 3E2 were more effective than that of 1A5. Epitopes of MAbs were identified by phage display technology. Epitope mapping revealed that the epitopes of 4A3 and 3C1 localized to TCR binding sites of SEBSEB, and 3E2 to MHC binding sites; ; while the epitope of 1A5 was near MHC binding sites. Finally, we constructed prepared bispecific (3C1-3E2) antibody by conjugating 3C1 and 3E2, and demonstrated 3C1-3E2 function synergistically to neutralize SEBSEB in vitro and in vivo. These results suggest that 3C1-3E2 neutralizes SEBSEB more effectively than each of the one MAbs alone. We predict that bispecific antibody produced by fusing two MAbs, which recognize different function epitopes on SEBSEB, , could have better neutralization potential against SEBSEB and serve as a novel immunotherapeutic candidate.四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文10缩略词表英文缩写英文缩写英文全称英文全称中文名称中文名称AmpAmpicillin氨卞青霉素bpBase Pair碱基对BSABovine Serum Albumin牛血清白蛋白DEPCDiethyl pyrocarbonatePyrocarbonate焦磷酸二乙酯dNTPDeoxyribonucleoside riphosphatesRiphosphates四种脱氧核苷酸DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EBEthidium Bromide溴化乙锭E.ColiEscherichia coli大肠杆菌ELISAEnzyme Llinked immunosorbent Immunosorbent assayAssay酶标记免疫吸附测定法FBSFetal Bovine Serum胎牛血清HRPHorseradish peroxidasePeroxidase辣根过氧化物酶mRNAMessenger RNA信使 RNANCNitrocellulose硝酸纤维素膜ODOptical densityDensity光密度PAGEPolyacrylamide gel Gel electrophoresisElectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphate-buffered salineSaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应PEGPolyethylene glycolGlycol聚乙二醇pfuPlaque Forming Unit噬菌斑形成单位rpmRounds per minute每分钟转速RT-PCRReverse transcriptase Transcriptase PCR逆转录 PCRSPDPN-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate 3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用11SEBSEBStaphylococcal enterotoxin Enterotoxin B金黄色葡萄球菌肠毒素 B四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文12前前 言言临床资料表明，革兰阳性(G )菌脓毒症的发病率逐年上升，其中金黄色葡萄球菌（(SEBStaphylococcus aureus全称）)发病率位居首位，是烧伤创面感染、和急性肝功能衰竭的重要病原菌。由于其致病因素复杂、耐药性不断增强，特别是中间型抗万古霉素金黄色葡萄球菌金葡菌的出现，金黄色葡萄球菌金葡菌感染所致脓毒症的防治已成为现代创伤外科和危重病医学面临的棘手难题之一。近年发现，造成医院感染的耐青霉素金黄色葡萄球菌，80% 以上产生SEB金黄色葡萄球菌肠毒素（(Staphylococcal Enterotoxin）)SEB。个别医院分离株几乎100%产肠毒素。其中金黄色葡萄球菌金葡菌肠毒素Staphylococcal Enterotoxin，尤其是肠毒素B (SEBStaphylococcal Enterotoxin B， SEB全称)因其“ “超抗原”特性以及在中毒性休克综合征发病中的特殊意义而倍受关注。近年发现，造成医院感染的耐青霉素金葡菌，80 以上产生SEB。个别医院分离株几乎100产肠毒素。金葡菌SEBSEB是一种细菌外毒素，为单一多肽链，耐酸，耐热。在沸水中，几分钟不变性，在冰点能保存一年以上。编码金葡菌SEBSEB的entB基因存位于在于？染色体上，由1 709个碱基对 bp组成1 1。起始密码子ATG存在位于244 核苷酸bp处， 起始ORF为798 bp。TAG终止密码在在1042 bp处,，开放阅读框架共798 bp，编码266个氨基酸。通过核苷酸编码推算，金葡菌SEB的分子量约为28366道尔顿，与根据氨基酸序列测出的分子量28500很相近。金葡菌SEBSEB的二级结构？为含29残基螺旋，71-折叠，88-转角，55不规则构象。最稳定的结构是二硫桥连周围的-折叠，有一半以上二硫桥与蛋白质三维结构和肽链B一构象有关。经x线衍射分析金葡菌SEBSEB的立体晶体结构显示， 金葡菌SEBSEB分子由两个结构域组成2。结构域1(N末端)由1-120个氨基酸1-120组成，结构域2(C末端)由127-239个氨基酸127-239组成，两者之间有6个氨基酸组成的桥。结构域1含有23个折叠层，由1、4和5组成，也含有螺旋1、2、3和1个双二硫键。两个折叠层形成一个圆柱状管。此外金葡菌SEBSEB氨基末端结构域内存在一个二硫环，二硫环内和附近的氨基酸残基与毒素的致吐效应有关，其确切机制尚不清楚。结构域2由两部分组成：第1部分由 抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用134和 5螺旋及8和11两个短链组成。，第2部分由6、7、9、10和12链组成。金葡菌SEBSEB属于超抗原，不需要APC的加工处理，以完整的蛋白质分子直接与在MHC II类分子的1结构域和TCR的B链V区结合，从而刺激T细胞活化增殖，同时释放大量细胞因子。激活T细胞 SEBSEB通过与MHC lI类分子和TCR形成一个三元复合物来激活T细胞，对T细胞的激活频率效率比普通抗原高1O03-1O05倍，因此，微量的金葡菌SEBSEB就能诱导机体产生免疫应答。S金葡菌SEB引起T细胞早期的活化过程，类似普通抗原与TCR的结合，包括磷脂酶C的活化，PKC的激活，从而使细胞内Ca2+ 浓度增高。这些早期活化的过程诱导淋巴因子的产生或淋巴因子受体表达，释放大量细胞因子。SEBSEB是NF-B的强激活剂。NF-B的拮抗剂可以减弱金葡菌SEBSEB诱导的T细胞激活 。与 SEB 相互作用的 V 残基是：骨架区域 2（FR2）的组氨酸（His）47,丙氨酸（Ala）52，甘氨酸(Gly)53,丝氨酸(Ser)54 和苏氨酸（Thr）55,骨架区 3 的谷氨酸（Glu）56,赖氨酸(Lys)57，酪氨酸(Tyr)65，赖氨酸(Lys)66 和丙氨酸(Ala)67，和高变区的脯氨酸(Pro)70，丝氨酸（Ser）71。FR2、CDR2、FR3 和 HV4对 SEB 的贡献分别占 7%，50%，34%和 9%。与 V 相互作用的 SEB 残基是：结构域 1 的天冬氨酸（Asn）60,酪氨酸(Tyr)90 和酪氨酸(Tyr)91。结构域 2 的苏氨酸（Thr）18，甘氨酸（Gly）19,亮氨酸(Leu)20,谷氨酸(Glu)22,天冬氨酸(Asn)23,酪氨酸(Tyr)26,天冬酰胺（Asn）60, 酪氨酸(Tyr)90,l 酪氨酸(Tyr)91苯丙氨酸(Phe)176 和谷氨酸（Glu）210。SEB 对不同的白细胞抗原分子有不同的亲和力，亲和力强弱依次为 HLA-DR-DP。 。SEB 与 MHC类分子的 1 结构域和 SEB 分子的 N 末端结构域之间，以低亲和力结合。SEB 和 HLA-DR1 间的主要作用是 SEB 的谷氨酸(Glu)67,，酪氨酸(Tyr)89 和赖氨酸(Lys)39HLA-DR1 的间形成的盐桥作用和 SEB 疏水端的侧链与 HLA-DR1 的 1 螺旋和 片层间区域相互作用。SEB 与 MHC作用位点还涉及到疏水区域的亮氨酸(Leu)45 和急性区域谷氨酸(Glu)67,，酪氨酸(Tyr)89 和酪氨酸(Tyr)115。SEB 与 TCR V 相互作用的氨基酸残基是：结构域 1 的天冬氨酸（(Asn）)60,，酪氨酸(Tyr)90 和酪氨酸(Tyr)91。结构域 2 的苏氨酸（(Thr）)四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文1418，甘氨酸（(Gly）)19,，亮氨酸(Leu)20,，谷氨酸(Glu)22,，天冬氨酸(Asn)23,，酪氨酸(Tyr)26,，天冬酰胺（(Asn）)60,， 酪氨酸(Tyr)90,，l 酪氨酸(Tyr)91苯丙氨酸(Phe)176 和谷氨酸（(Glu）)210。点突变这些氨基酸中任何关键区域，都破坏 SEB 与 MHC和 TCR 的结合。对 SEB 治病机制的认识，为治疗 SEB 引起的疾病提供了更好的解决方法。通过阻断 SEB 与 TCRV 和/或 MHC分子的结合，从而抑制 SEB 发挥作用。抗SEB 单克隆抗体通过与 SEB 的结合，阻断了 SEB 与 TCRV 或 MHC分子结合，阻断 SEB 激活 T 细胞及触发炎症因子的释放。目前有报道的单克隆抗体抗体有几十株3,但其中和保护作用绝大多数停留在体外试验阶段，并且 SEB 单克隆体的体只能起到部分中和保护作用4。限制了抗 SEB 单克隆抗体的发展，而科研工作者也从别的位点出发寻找治疗 SEB 的分子药物。Buonpane, R.A., et al.制备了可溶性的，高亲和力 V 受体拮抗剂5，阻断 SEB 的作用，能达到完全中和效果。因此寻找高亲和力的抗体或小分子药物治疗 SEB 引起的疾病仍是一个有效地方法。目前针对 SEB 诱导的中毒性休克尚无有效的方法在人体中应用。静脉输注混合人体血清在一定程度上能缓解症状，但由于其来源的有限性和效果的多变性，它的应用受到的很大限制 目前尚没有有效的治疗方法中和人体中 SEB 介导 T 细胞活性。有报道用静脉注射法注射人免疫球蛋白混合物治疗SEB 引起的疾病，这种方法有一定的作用效果。但是免疫球蛋白的供应量有限，并且疗效不稳定3，,4。有多个研究组也获得了一些小鼠抗 SEB 的中和性单克隆抗体 鼠抗 SEB 的单克隆体的有文献报道5，,6，但只能达到部分的中和保护效果(63%)但是单克隆抗体只能实现部分中和作用6。在 SEB 诱导的小鼠中毒性休克综合症模型中， ，来源于 SEB 的 中和性肽段7和 T 细胞受体拮抗剂展示了更较好的中和保护效果 8。此外，有有 MHCDR1 区域和 TCRV区域通过连接子构成的双特异性嵌合型抑制体的双特异性嵌合型抑制体，被设计用于与 SEB 结合。双特异性嵌合型抑制体能有效能阻止 SEB 与抗原递呈细胞上的 MHC分子和 T 细胞上的 TCR 的结合9。但是，由于其无法清除人体内的 SEB，因而以上的治疗方法都有一定的局限性，不能从人体内清除 SEB。 本课题应用杂交瘤技术制备了10株抗SEB单克隆抗体，其中4株单克隆抗体与SEB有较高的亲和力。我们对这4株单克隆抗体做了进一步的研究，应用噬菌抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用15体展示随机肽库技术筛选并鉴定4个单克隆抗体的抗原表位。在体外T细胞增殖实验，细胞因子分泌实验和体内小鼠生存率实验，及细胞因子分泌实验中，观察到发现4株抗体均有中和保护作用，其中4A3，3C1和3E2中和效果强于1A5抗体。 由于3C1和3E2抗体识别不同的抗原表位，我们利用化学偶联SPDP法，将3C1和3E2偶联构成同时识别TCR和MHC结合域的双功能性抗体。针对SEB表面不同功能表位的双功能抗体或单抗联合使用在体内外对SEB的中和活性具有显著的协同作用，提示抗体的耦联偶联对抗体各自功能的发挥没有影响。通过化学偶联试剂SPDP把此两株单克隆抗体偶联到一起，构建了3C1-3E2双功能抗体。通过体内外实验证实3C1-3E2双功能抗体有功能协同作用，作用效果与单纯抗体使用时有明显差异。抗SEB双功能抗体有潜力成为一种新的免疫治疗候选策略。Coutant2观察了化学半抗原、金属变应原和金葡菌SEB对人单核细胞衍生的树突状细胞(DC)的活性调节，发现金葡菌SEB在体内有强大的刺激效应，使DC的HLADR分子表达和TNF-释放强烈上调。金葡菌SEB冲击后的DC显示对T细胞较强的刺激活性，此时DC是主要的APC以介导超抗原活化T细胞，并在超抗原所致的T细胞克隆扩增中起重要作用。在使用SEB6小时后DC共刺激分子CD80、CD86、CD40表达明显上调。因为NK细胞表面缺乏识别SAg的TCRV受体，故金葡菌SEB不能直接激活NK细胞，所以SEB先通过激活T细胞释放大量细胞因子进而激活NK细胞而实现，IL-2、IL-12、IFN-等能使NK细胞活化。被激活的NK细胞称为超抗原激活的杀伤细胞(SAKC)，能杀伤对NK细胞不敏感的肿瘤细胞，从而产生LAK(Lymphokine- activated killer cells)样细胞毒作用，抑制肿瘤生长。金葡菌SEB同样诱导出大量CD4+ CD16+ NK T细胞。这些NK T细胞直接参与了金葡菌SEB诱导抗排斥作用和耐受性调节，并有可能参与促进了T细胞朝Th2细胞分化的过程 3。金葡菌SEB诱导的免疫应答中，NK T细胞扮演着调节性T细胞的角色，能够调节细胞因子的释放。NK T细胞能够促进IL-4的分泌，下调TNF-的分泌4。毒素休克综合征表现为高热、脱皮、高血压、休克和其他症状，由金葡菌SEB引起的毒素休克综合症的病死率可达50，而与流感并发的金葡菌SEB感染其死亡率可达90以上，因此气溶胶中的金葡菌SEB是一种潜在的生化武器。金四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文16葡菌SEB引起毒素休克综合征主要是由于金葡菌SEB进人机体后，其超抗原的结合引起单个核细胞活化，导致广泛的细胞因子释放。在中毒性休克中，死亡率和细胞因子主要取决于TCR T细胞，早期由TCR T细胞释放的TNF对死亡的发生起了重要的作用。金葡菌SEB抗肿瘤的机制为SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用(Superantigendependent cellularcvtotoxicity SDCC)和细胞因子的直接或间接杀伤作用。在SAg直接刺激下，CTI 大量被激活，各亚类T细胞激活分泌多种细胞因子，包括TNF- 、TNF-、INF、IL-2、IL-6和IL-l2，从而对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。Kuge等5发现，SEA或SEB能激活CTL，杀伤MHCII类抗原阳性的结肠癌细胞。 本课题中应用杂交瘤计数制备了10株抗SEB单克隆抗体，其中4株中和作用显著。我们进一步研究了这4株抗体的作用，应用噬菌体随机肽库技术契合筛选并鉴定4个抗体的抗原表位。在体外T细胞增殖实验，细胞因子分泌实验和体内小鼠率实验，及细胞因子分泌实验中，均观察到4株抗体的中和保护作用，其中4A3，3C1 和3E2效果好于1A5抗体中和效果。 由于3C1和3E2抗体有不同的抗原表位，我们通过化学偶联试剂SPDP把此两株抗体连到一起，构建了3C1-3E2双功能抗体。通过体内外实验证实3C1-3E2双功能抗体有功能协同作用，作用效果与单纯抗体使用时有明显差异。这为治疗SEB引起的疾病提供了一新颖的免疫治疗方法。抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用17第一部分一章 小鼠鼠抗 SEBSEB 单克隆抗体的制备一、一、 材料与方法材料与方法 主要试剂和仪器主要试剂和仪器 细胞株细胞株 小鼠骨髓瘤细胞株NS1：本室保存 实验动物实验动物 Balb/c小鼠：6-8周龄，购自中国科学院上海动物中心，饲养于第二军医大学动物中心 载体载体 pGEM-T easy：Promega公司pPICZA：本所保存 菌种菌种 大肠杆菌TG1：Amersham Pharmacia公司 工具酶工具酶 限制性内切酶：New England BiolabsT4 DNA连接酶：New England Biolabs 高保真Taq聚合酶：Roche公司 试剂盒试剂盒 小量质粒抽提纯化试剂盒：上海华舜生物工程公司 胶回收试剂盒：上海华舜生物工程公司 RT-PCR反转录试剂盒：Takara宝生物公司 引物引物 引物序列由上海生工公司予以合成 主要试剂主要试剂 Trizol Reagent：Invitrogen公司 FBS：GIBCO公司四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文18辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体（(Goat anti-mouse-HRP）):：Santaara细胞冻存液：30%胎牛血清10%DMSO60%无血清培养基，过滤除菌主要仪器设备主要仪器设备 PCR仪：MJ Research公司 复日FR-980生物电泳图像分析系统：上海复日生物实验技术公司 UV-2401PC紫外分光光度计：Shimadzu公司 5810R台式低温离心机：Eppendorf公司 电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司 Spectra型酶标仪：Tecan96孔酶标板：Greiner方方 法法 1.1. SEBSEBSEBSEB基因的构建、蛋白的表达纯化基因的构建、蛋白的表达纯化 1.11.1 构建构建SEBSEBSEBSEB原核表达原核表达表达表达质粒质粒根据全基因合成的SEB真和表达基因载体片段，设计引物扩增目的片段。为克隆表达SEB基因，我们参照GENEBANK的SEB序列(序列号:：NC-002951),，全基因合成了SEB原核基因片段。ATTGTCGACTGACGACGACGACAAGATGTATAAGCGTCTGTTTATTTCCCATGTAATTCTGATCTTCGCACTGATCCTGGTTATTTCTACCCCGAACGTTCTGGCAGAGTCCCAGCCGGATCCGAAACCGGATGAGCTGCACAAATCCTCCAAATTCACTGGTCTGATGGAAAACATGAAAGTTCTGTACGATGATAACCACGTATCCGCTATCAACGTTAAATCCATCGACCAGTTCCTGTACTTCGACCTGATCTACTCCATCAAAGACACTAAACTGGGTAACTACGATAACGTTCGTGTTGAATTTAAAAACAAAGATCTGGCTGACAAATACAAAGACAAATACGTTGACGTTTTCGGTGCTAACTACTACTACCAGTGCTACTTCTCCAAAAAAACCAACGACATCAACTCCCACCAGACCGACAAACGTAAAACCTGCATGTACGGTGGTGTTACCGAACACAACGGTAACCAGCTGGACAAATACCGTTCCATCACCGTTCGTGTTTTCGAAGACGGTAAAAACCTGCTGTCCTTCGACGTTCAGACCAACAAAAAAAAAGTTACCGCTCAGGAACTGGACTACCTGACCCGTCACTACC抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用19TGGTTAAAAACAAAAAACTGTACGAATTCAACAACTCCCCTTACGAAACCGGTTACATCAAATTCATCGAAAACGAAAACTCCTTCTGGTACGACATGATGCCGGCTCCGGGTGACAAATTCGACCAGTCCAAATACCTGATGATGTACAACGACAACAAAATGGTTGACTCCAAAGACGTTAAAATCGAAGTTTACCTGACCACCAAGAAAAAGTAAGCGGCCGCAAT 其中方框部分为酶切位点：GTCGAC 为 Sal I 酶切位点，GCGGCCGC 为 Not I酶切位点,，GACGACGACGACAAG 为 EK 酶切位点。斜体字母为根据密码子使用频率进行的突变，氨基酸序列不变。并设计了 pGEX-4T-2 载体引物，通过 PCR 扩增 SEB 基因 4Tsense-1:5-ATTGTCGACTGACGACGACGACAAG ATGTATAAGCGTCTGTTT-3；4Tantisene: 5-ATTGCGGCCGCTTACTTTTTCTT GGTGGTCAG-3。4Tsense-1:5-ATTGTCGACTGACGACGACGACAAGATGTATAAGCGTCTGTTT-3；4Tantisene:5-ATTGCGGCCGCTTACTTTTTCTTGGTGGTCAG-3。其中下方框部分为酶切位点：GTCGAC 为 Sal I 酶切位点，GCGGCCGC 为 Not I 酶切位点,GACGACGACGACAAG 为 EK 酶切位点。按照以下配制PCR反应液： DNA片段 2 l 10PCR缓冲液（(含Mg2+2+）) 5 l Forward引物 (10 pmol/l) 1 l Reverse引物(10 pmol/l) 1 l dNTP混合物(2.5 mM each) 4 l 高保真Taq聚合酶 0.75 l 四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文20灭菌双蒸水 36.25 l 总体积 50 l 94，2 min 94，15 sec；55，30 sec；72，45 sec（(35 cycles）) 72，7 min 10，hold 配制1%琼脂糖，凝胶电泳分离鉴定目的片段。胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与pGEXPgex-4T-2载体连接，转化DHBL5感受态细胞，铺LB-Amp平板。从平板上挑取单克隆进行Sal I和Not I双酶切鉴定，阳性克隆做SEBSEB诱导表达。 1.21.2 SEBSEBSEBSEB蛋白的原核表达蛋白的原核表达 SEBSEBSEBSEB诱导菌的准备诱导菌的准备 取鉴定的SEBSEB阳性克隆甘油菌，接种于5 ml LB培养基，培养基中Amp浓度100 g/ml。37，250 rpm 恒温摇床培养细胞，直到细菌OD600到1.2。取出1 ml菌液，室温，全速，5 min离心，倒掉上清液，加入Tris (200 l 20 mMm/ml，pH8.0)裂解液 超声裂解细菌，直到细菌液体呈透明澄清，离心收集上清液，即为诱导前的SEBSEB蛋白。IPTGIPTG诱导表达诱导表达剩余菌液中加入IPTG，IPTG的浓度分别是0.2 mM,， 0.4 mM,， 0.6 mM,， 0.8 mM,， 1.0 mM,， 20诱导2 h,， 室温，全速，5min离心，倒掉上清液，加入Tris (200 l 20 mM/ml，pH8.0)200 l 20 Mm/ml，pH8.0 Tris 裂解液超声裂解细菌，直到细菌液体呈透明澄清，离心收集上清液，即为诱导后的SEBSEB蛋白。10% SDS电泳通过考马斯亮蓝染色鉴定表达的SEBSEB蛋白。1.31.3 SEBSEBSEBSEB蛋白大量的制备、纯化蛋白大量的制备、纯化抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用21 选取最佳的表达诱导条件，20，IPTG浓度0.5 nM,，进行大量诱导表达。收集好的细菌，用Tris (200 l 20 mM/ml，pH8.0，20 mM/ml，pH8.0 Tris（按照1：:20的比例加裂解液）),，通过超声裂解细菌，到菌液不在黏稠，4，6000 rpm,，15 min 高速离心收集上清。通过Protein 分子筛GST亲和层析柱纯化SEBSEB-GST蛋白。将SEB-GST蛋白经EK酶酶切后，再次过GST亲和层析柱，收集流穿液，浓缩后即获得纯的SEB蛋白。2.2. 鼠抗鼠抗SEBSEB人人OPNOPN单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 免疫免疫Balb/cBalb/c小鼠小鼠 Balb/c小鼠，6-8周龄，雌性较好。每三只为一组。初次免疫:福氏完全佐剂和溶于PBS的抗原（(纯化后的人SEBSEB蛋白）)以1:1充分混合，达到“ “油包水”的状态为最佳。抗原剂量为100 g每只鼠。腹腔注射每只小鼠0.2 ml。二次免疫:在初次免疫2周后进行。福氏不完全佐剂和溶于PBS的抗原以1:1充分混合。剂量与初次免疫相同。每只腹腔注射0.2 ml。第三次免疫：在二次免疫的三周后进行。福氏不完全佐剂和溶于PBS的抗原以l:1 充分混合。剂量与前两次相同。腹腔注射0.2 ml。并在5-7天后取眼眶血分离血清，纯化的SEBSEB包被酶标板，以ELISA检测小鼠血清中SEBSEB抗体的滴度。加强免疫：第三次免疫后3周，可以进行加强免疫。不需要加佐剂，剂量可以加倍，0.2 ml腹腔注射。三天后可以进行融合实验。NS1骨髓瘤细胞实验前两周左右开始复苏。融合前准备4-6瓶状态好的细胞备用。用RPMI1640培养。胎牛血清10%，最大密度106106/ml，37 ,， 5% CO22培养。2-3天传代一次。一瓶分三瓶。融合前要求保证其处于对数生长期。冻存液为60%1640不完全培养基，30%胎牛血清，10%DMSO。融合实验前后需制备饲养细胞。其主要作用是可以提供细胞密度，吞噬死细胞和分泌细胞生长因子等。饲养细胞饲养细胞 饲养细胞的制备具体步骤： 1)采用与免疫小鼠相同的品系的小鼠。 2)引颈处死，浸泡于70%酒精中5-10 min分钟。 3)无菌操作，剪开皮肤，充分暴露腹膜。 四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文22 4)用0预冷的注射器（(大号针头）)注入5 m1的0预冷不完全培养基。 5)挤压腹膜，吸出培养基。注意针孔朝上，缓慢吸抽，并配合挤压腹膜，使液体汇聚。可以吸出4-5 m1ml。 6)用0预冷的20%FBS培养基补足用量。（(一只鼠可以制备2-3板，无需计数）)加HAT（(或 H T）)培养基和双抗。 7)细胞培养板每孔加100 l。 8)37，5% C02CO2培养。 融合实验融合实验 融合实验具体步骤: ： 免疫小鼠脾细胞的分离 弯头镊子取眼血，离心，取血清保存。引颈处死免疫鼠，于70%酒精中消毒10 min分钟。颈椎脱臼法处死小鼠；取脾脏，过200目钢网进行研磨，PBS冲洗；离心分离细胞，PBS洗涤1遍。1000 rpm 转5 min分钟。弃上清，用无血清预热培养基悬起细胞，计数。（(约51077-21088个细胞/脾脏）) 瘤细胞的制备(最适密度3.5-9105/m1) 收集NS1细胞。800 rpm 5 min800转5分钟。弃上清。37预热不完全培养基悬起细胞。计数。收集细胞以1:5的比例加入融合瓶中。1000 rpm 5 min1000转5分钟。尽可能去尽上清，敲击瓶底使细胞松散均匀。 融合细胞（(在37水浴条件下进行）) 边晃动融合瓶边加入37预热PEG1450（(Sigma促融合用PEG）)。 120sec 0.5 ml PEG 。30 sec 静止。 60 sec 1 ml 1640不完全培养基 。60 sec l ml 1640不完全培养基 。30 sec 2 ml 1640不完全培养基 。30 sec 3 ml 1640不完全培养基。 静止5 min分钟。 600 rpm 5 min600转5分钟。去上清。并洗涤一次。 抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用23补足培养基20% FBS。每孔100 l，37，5 %CO022培养。 第3,， 6,， 9,， 12天换液。12天换HT完全培养基。 杂交瘤细胞的选择和培养杂交瘤细胞的选择和培养 杂交瘤细胞的选择：融合实验的第三天后可以观察到融合的细胞，这时候要轻拿轻放。融合实验的第7天在显微镜下观察杂交瘤细胞的群落，并加以记录。在换液的时候抽取其上清液进行ELISA检测，检测结果加以记录分析，选择阳性较好的孔重点培养，准备克隆化。 克隆化培养：对阳性较好的孔，可在融合两周后（(长满培养板的1/10时）)开始克隆化培养。采用有限稀释法。 制备饲养细胞。把阳性较好的孔中细胞吹悬计数，以每孔0.8个细胞的数量加到培养板中。 剩余的细胞培养到长满培养孔的1/2时可以转到二十四孔板继续培养，既而再转入培养瓶中，注意冻存保存。冻存液60%1640不完全基，30%胎牛血清，10%DMSO。 克隆化细胞板要进行ELISA检测，与阴性小鼠对照，如有阴性孔则需要继续培养，继续选择阳性孔扩大克隆化培养，一直到所有孔检测均为阳性孔时，培养，冻存，得到单克隆细胞株。 3.单克隆抗体相对亲和力测定单克隆抗体相对亲和力测定 SEBSEB蛋白用NaCO3盐包被液稀释到1 g/ml，加100 l到酶标板，4包被过夜。 以1 g/ml SEBSEB蛋白包被96孔酶联板（(NaCO3盐包被液，pH 9.6）)，每孔100 l，4孵育过夜。 倾去包被液，加入封闭液10%的脱脂奶粉，4封闭2 h。 倾去封闭液，PBST洗6次。 梯度稀释的10株单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清，每孔100 l，37，1 h。 倾去液体，PBST洗6次。每孔加入羊抗鼠HRP抗体 (1:12000) 100 l，室温孵育l h。 按照上述方法洗涤后，加入TMB显色，测定A450 nm处的吸光值。4.4.抗体与抗体与SEBSEBSEBSEB抗原亲和活力测定抗原亲和活力测定四川大学硕士学位论文四川大学硕士学位论文24 SEBSEB蛋白包被：装入新的Chips，50nM的SEBSEB蛋白配置于不同pH的20 mM NaAC溶液中（(pH4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）)，分别注射于Phamacia仪器BIACORE 3000，流速10 l/min，回应（(response）)最强的包被条件为最佳抗原与Chips结合的条件。同时包被鼠源单克隆抗体4G2B5作为参照，控制Responses在500以内。 Chips的再生：分别用100 mM Glycine-HCL（(pH2.2）)、0.1mM HCL（(pH2.2）)及6M盐酸胍作为再生溶液摸索Chips再生的最佳条件，注入不同浓度样品于BIACORE 3000中，流速30 l/min，观察基线是否稳定，以各点Responses之差小于5的再生系统为最佳系统。 样品亲和活性的测定：单克隆抗体样品经系列稀释成不同浓度（(1 M，800 nM，400 nM，200 nM，100 nM，50 nM，25 nM）)分别注入BIACORE仪器，流速30 l/min，再生溶液为6M盐酸胍，再生后稳定时间为3 min，注入时间2 min，解离时间为10 min，同时以BSA作为参照。利用软件BIAevaluation 3.1数据处理，计算亲和常数Kd，Associate Rate（(Kon）)，Dissociate Rate（(Koff）)。二、二、 结结 果果 本实验旨在得到SEBSEB毒素蛋白，对SEBSEB蛋白进行蛋白表达和纯化，以SEB蛋白，免疫动物小鼠，应用杂交瘤技术制备单克隆抗体，并鉴定单克隆抗体的性质。 1.SEBSEBSEBSEB原核基因的原核基因的扩增扩增克隆克隆和蛋白表达纯化和蛋白表达纯化 为克隆表达SEBSEB基因，SEB原核基因的扩增及蛋白表达纯化（图所示PCR扩增，小量诱导表达，大量诱导表达）我们参照GENEBANK的SEBSEB序列（(序列号:：NC-002951 ）)，获得SEBSEB原始DNA序列，为使该基因得到高效表达，我们根据原核基因密码子使用频率，对SEBSEB的基因序列进行了多位点的突变，并据此进行了全基因合成。为方便克隆表达和纯化，我们在该基因的5端加入了EK酶酶切位点，并在基因两端分别加上相应的限制型内切酶识别位点。抗金黄色葡萄球菌肠毒素抗金黄色葡萄球菌肠毒素 B B 单克隆抗体的特性与中和保护作用单克隆抗体的特性与中和保护作用金黄色葡萄球菌肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素 B 抗体的免疫学特性和保护作用抗体的免疫学特性和保护作用25SEBSEB元和基因PCR扩增的产物见图1A，课件可见在1%琼脂糖凝胶电泳上，800 bp附近有特异性的条带，和预期818 bp条带大小相近。将PCR常务产物胶回收。连接到着至PgexpGEX-4T-2载体，挑取克隆，进行Sal I+Not I双酶切鉴定（(图示图1B）)，将阳性克隆进行小量诱导表达，选取最佳的SEBSEB诱导表达条件。不同条件的诱导表达蛋白情况，经SDS鉴定（(如图1C）)。得到最佳的诱导表达条件20，IPTG 0.5 mM,， 4小时，进行大量诱导表达，表达的蛋白经Protein GST亲和层析柱纯分子筛纯化后，10% SDS鉴定SEBSEB-GST蛋白（(图1D）)。图 1 SEBSEB基因的克隆和蛋白纯化Figure 1 The clonine , expression and purification of SEBSEB(A) SEBSEB原核基因PCR扩增产物，得到818bp大小的特异性条带。（(B）) SEBSEB基因的酶切鉴定。挑取的克隆进行Sal I 和Not I双酶切酶切，均有插入片段。（(C）) SEBSEB-GST蛋白诱导10%变性SDS电泳结果。Lane 1,，诱导前SEBSEB-GST蛋白表达量，Lane2-6 诱导2 h,，IPTG浓度为0.2 mM，0.4 mM，0.6 mM，0.8 mM，1.0 mM SEBSEB-GST蛋白表达量。（(D）) SEBSEB-GST大量诱导表达产物。Lane 1