细胞培养技术在医药研究中的应用

细胞培养技术在医药研究中的应用摘要：近年来，动物细胞培养技术成为生物制药领域最受关注的焦点之一，动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞的高密度培养，推动现代生物医药产业的发展。 动物细胞培养是离散动物活细胞体外模拟体内：生理环境，在无菌、适当培养条件下生长繁殖的过程。 可以利用人工培养的动物细胞进行科学研究和生物制药，动物细胞的大规模培养技术是生物制药中非常重要的环节。 在动物细胞培养过程中，最重要的是优化细胞培养条件，尽量排除或减轻环境对细胞的影响，控制动物细胞培养环境是细胞培养的相关技术。关键词动物细胞培养技术，生物制药，培养条件，人工培养。自1885年起，Roux从鸡胚中分离细胞后首次建立体外细胞培养的Dulbecco自1943年开始进行单层细胞培养已有半个多世纪。 由于其培养简单、操作方便、消耗少、运用大量等优点，广泛应用于生命科学的各个领域1 . 世界生物制药技术和市场的快速发展为动物细胞培养基市场提供了快速的生长环境，保持了强大的发展势头。1细胞培养的环境和条件1.1无污染环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞体外培养成功的首要条件3 .1.2适当的温度维持培养细胞的旺盛生长需要一定的适当温度。 不同类型细胞对培养温度的要求也不同3。1.3气体环境和氢离子浓度气体是哺乳动物细胞培养的必要条件之一，必要的气体主要是氧气和二氧化碳3。1.4适当的p H值每个细胞都有最佳的p H值。 p H值随培养细胞种类的不同而不同，多数细胞的适宜p H为7.2至7.4，超出该范围对细胞培养有害3 .1.5培养基培养基不仅提供促进细胞营养和细胞生长增殖的基础物质，还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境3 .1.6细胞培养外部环境细胞培养是无菌操作技术，对实验室、常用设施和设备、培养器具等要求很高3 .2细胞培养无菌操作的基本技术无菌操作技术分为：个作业环境和表面、用于细胞培养的器具、培养液和培养细胞的处理。2.1工作环境的处理使用层流超纯表是最经济有效的手段3。2.2用于细胞培养的玻璃及塑料制品的清洗和消毒消毒方法可分为物理灭菌法(紫外线、湿热、干燥、过滤等)、化学灭菌法(各种化学消毒剂)和抗生素3种。 3细胞培养基质量标准和产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标准的现状，着重考虑生物制药用户对产品质量的要求和中华人民共和国药典的有关规定，在清大日制定了包括外观、溶解性、pH值、干重、渗透压、细菌内毒素、微生物限度、细胞生长试验共8项细胞培养基产品质量标准5 .1.1外观肉眼观察产品颜色、粉末细度均匀性5。1.2溶解性通过对溶于水的细胞培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的溶解性。 要求规定量的试样，加入1 L注射用水(水温2030 )，搅拌溶解，澄清溶液5。1.3 pH值要求规定量的供试品，用注射用水(水温2030)溶解于1 L，向上述溶液中加入规定量的碳酸氢钠，用接近细胞培养基溶液pH的2种标准缓冲液校正pH计，进行pH测定。 将每个细胞培养基产品的pH容许偏差规定为0.35。1.4干燥减量细胞培养基具有吸湿性，放置在空气中后水分立即上升，干燥重量下降，显示产品中的水分含量。 控制细胞培养基的水分可以防止微生物繁殖，保持细胞培养基的养分。 规定细胞培养基的干燥减量为5 % 5。1.5渗透压因为细胞必须在等渗透环境下生活，所以必须控制培养基的渗透压范围。 将各细胞培养基产品渗透压值的允许偏差范围规定为5 % (5)。1.6内毒素细菌内毒素是细菌死亡或解体后才释放出来的具有生物活性的物质。 培养基细菌内毒素含量过高对生物产品质量影响较大，降低生物产品生产率。 因此，清大日将中华人民共和国药典疫苗、基因工程药品等注射药按照细菌内毒素检测的规定，将细菌内毒素检测增加为细胞培养基的质量标准之一。 规定普通细胞培养基的细菌内毒素标准为10 EU/ml(EU :细菌内毒素单位) 5。1.7微生物限度细胞培养基不是无菌产品，其中微生物在一定条件下吸收和繁殖细胞培养基中的营养物质，引起细胞培养基的变质。 控制细胞培养基中的细菌和霉菌是延长细胞培养基有效期的方法之一。 每克细胞培养基产品的细菌数不得超过200 CFU (菌落形成单位)，霉菌数不得超过50CFU。 该标准严格于中华人民共和国药典 (2005版)口服制剂的微生物限度标准5 .1.8细胞生长试验目前国内尚无细胞培养和计数的法定方法，但以体外培养的原理与技术对细胞计数法的论述为参考，细胞在37的恒温条件下，在含体积分率为10%的小牛血清的细胞培养液中生长4872 h，细胞形态呈纤维状，贴壁生长，72 h内细胞数为5104细胞/ml至1105细胞/达到ml的细胞生长4872 h后，更换不含犊牛血清的细胞培养液，继续培养48，细胞形态呈纤维状，贴壁生长，细胞数必须在1105细胞/ml5以上。动物细胞的特征和生长特性运动生物细胞像微生物细胞一样，可以用人工控制条件的生物反应器进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比存在显着差异：动物细胞比微生物细胞大得多，没有细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力低倍增时间长， 生长缓慢，易受微生物污染，培养时必须使用抗生素培养过程需氧量少培养中细胞相互粘附以簇状存在原代培养细胞一般在繁殖50多岁时退化死亡代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高2 .二、动物细胞培养技术的发展动物细胞培养技术生产大分子生物制品始于1960年代，当时是为了满足疫苗生产的需要。 随后，随着培养技术的成熟和转基因技术的发展和应用，发现利用动物细胞培养技术生产大分子药用蛋白质具有优于原核细胞表达系统的优势。 重组DNA技术修饰的动物细胞能够正常加工、折叠、糖基化、运输、组装和分泌，因此细菌系统的表达产物常常作为惰性包容体存在。 随着大量永生性细胞株的制备，在商业利益刺激下，动物细胞培养技术也得到了迅速发展和应用。 动物细胞培养主要用于生产激素、疫苗、单克隆抗体、酶、多肽等功能性蛋白质，皮肤、血管、心脏、脑、肝脏、肾脏、肠等组织器官。 在医药工业和医学工程的发展中占有重要地位。 动物细胞培育生产药品是生物制药领域的重要方面，具有重大的经济效益和社会效益。 生物技术在过去10年间显着成长，持续快速发展，在未来几十年内，更多的蛋白质、抗体、肽类药物从动物细胞中培养出来。 随着生物技术的进一步发展，开发的动物细胞生产生物产品种类的增加和产品周期短、安全等优点，强调动物细胞生产生物产品优势的发展越来越快2 .动物细胞在生物制药开发中的重要性很重要，在产品开发等各个阶段都取得了很大的进步。 随着所使用的哺乳动物细胞种类的增多，最早的哺乳动物细胞是杂交瘤细胞，它在生物制药中被用于安全性高的哺乳动物细胞。 在单抗生产中必须选择该细胞，在药品质量越来越受到重视的情况下，治疗性单抗成为近年来发展最快的生物技术药物，1997年，美国只有2种治疗性单克隆抗体获得发售许可，近年来批准了15种，发展速度快，研究人员也深入了解。 基因工程技术构建的工程细胞株，不仅在生物制药中表达门诊目的蛋白，而且还可作为基因治疗产品制作辅助包装细胞等生物制药过程的辅助细胞。 将患者细胞转基因处理后放回体内治疗是近年来转基因细胞技术的另一重要用途。 不论其用途如何，通用技术程序都与高效工程细胞系的构建有关4 .动物细胞培养也需要注意以下问题：(1)工程细胞培养方式；构建工程细胞株时，需要大规模细胞进行药物生产，哺乳动物细胞的大规模培养方式，这些都需要在构建工程细胞株时加以大规模设计。 另外，一些凋亡细胞能够从反应器中排出，对于大规模生产也是非常重要的。 2种常用外源启动子CMV和SV40需要细胞株保持一定的生长速度，培养中的细胞大多能在s期提高细胞表达产物，促进反应器的循环4 .(2)优化培养基；在细胞培养过程中，培养基的作用尤其重要，是大量生产的物质基础，与蛋白、脂质、核酸、合成有密切关系，因此需要优化该条件4 .(3)大规模培养的监测在大规模的细胞培养培养过程中，需要监测细胞的生长速度、新陈代谢和凋亡速度。 生产中的DO2和培养温度对整个培养过程有很大影响。 许多研究表明，培养温度下降2天后，s期细胞数量明显减少，细胞新陈代谢活动缓慢，部分工程细胞死亡程度降低。 细胞培养过程调控的本质是细胞生长、代谢、死亡率的调控。 温度、溶解氧对细胞表达产物和细胞生长、代谢和产物结构有显着影响。 实验表明，温度从37接近3048 h后，s期细胞大幅降低，G0/G1期细胞大幅增加，与细胞生长速度相关的u比同事降低，细胞凋亡减缓。 细胞产生三磷酸腺苷的活动减少了50%，总代谢水平明显下降。 对于某些产品，如红细胞生长周期变长，可水解蛋白质的酶类释放速度降低，可提高红细胞生长的糖基化程度，提高产品的比活4 .3未来与展望细胞培养法已广泛应用于许多优点，但随着细胞培养技术的进一步完善，也发现了许多缺点。 例如，对细胞在体内的生存环境几乎没有反应，不能显示细胞和细胞的相互作用等。 众所周知，人体各细胞的基因组相同，但组织器官中有不同的表型和功能细胞，细胞所处环境、周围结构和力学特征对基因表达有非常重要的影响。 培养系统具有缩短实验次数、减少用药量等优点。 通过构建细胞培养模型，可以大大模拟体内环境，观察细胞与细胞的相互作用，弥补单层细胞培养无法表达细胞间相互作用的缺陷，在生命科学领域的研究和实用具有广阔的前景。参考文献1罗云1、孙桂波1、秦蒙1、姚帆2、孙晓波1 .细胞共培养技术在医药研究中的应用2 .哈尔滨商业大学药学部、黑龙江哈尔滨150076 )2吴旭国.细胞大规模培养技术在生物制药中的应用.哈尔滨三木制药厂.黑龙江五常. 1502323郭树华、刘瑞明、浅谈动物细胞体外培养的环境与条件.金宇保灵生