一种连接融合蛋白和阳离子抗菌肽的简便方法

一种融合蛋白X与阳离子抗菌肽的连接方法，其特征在于连接产物具有如下核苷酸序列：a . SEQ ID: NO 1；B. SEQ ID:NO 2。2.根据权利要求1的连接产物，其特征在于它编码一个氨基酸序列：SEQ编码：第3位，SEQ编码：第4.3位。根据权利要求1和2所述的聚合酶链反应产物，其特征在于，所述1，2个直平端通过T4 DNA连接酶连接，并且所述阳离子抗菌肽的毒性通过融合蛋白的负电荷被抑制。4.根据权利要求1、2和3所述的连接片段，其特征在于，所述靶抗菌肽在前面含有酸水解位点，这有利于所述融合蛋白的分离和纯化。5.根据权利要求1、2、3和4的大肠杆菌遗传工程菌及其重组质粒，其特征在于在生产阳离子抗微生物肽中的应用。本发明属于基因工程技术领域，涉及利用平端连接将融合蛋白基因与阳离子抗菌肽基因连接，将连接产物插入相应的质粒，转化大肠杆菌BL21的感受态细胞，生产抗菌肽。发明背景有两种类型的连接的DNA末端，粘性末端和扁平末端，因为粘性末端具有较高的连接效率，前者通常在正常情况下使用。然而，对于任何DNA片段的拼接，平端是简单和容易操作和广泛使用的。在分子生物学的研究中，外源DNA片段的连接相当普遍。目前，重叠聚合酶链反应主要用于剪接较长的片段。需要设计更多的引物来进行多重聚合酶链反应。有时退火温度的差异给实验带来不便，增加了工作量。此时，我们可以考虑采用平端连接法，在两段引物的5端设计相应的切割位点和保护碱基，在获得聚合酶链反应产物后，在较低的退火温度下与T4 DNA连接酶进行连接反应，从而获得几条不同大小的条带，只回收目标产物预期大小的片段。对于多段拼接，连接平端的简单优势将更加明显。阳离子抗菌肽(AMPs)是两性小分子活性肽，在诱导条件下由生物体免疫系统产生净正电荷。阳离子抗菌肽通过与膜上的阴离子相互作用破坏膜结构，形成离子通道释放细胞质，然后细菌被溶解并死亡。这种独特的杀菌机制不容易产生耐药菌株。采用融合表达的策略，即利用各种带净电荷的融合蛋白抑制目标抗菌肽对宿主细胞的毒性，诱导表达后，通过相关切割方法去除融合蛋白，恢复活性。这样，不仅可以获得更大的表达量，而且可以以更低的纯化成本获得具有生物活性的抗菌肽。发明概述本发明设计了一种带有更多负电荷的融合蛋白。将抗菌肽基因剪接到融合头基因的下游获得连接产物，插入分泌表达质粒，转化大肠杆菌表达。融合头具有以下效果：2 .抑制抗菌肽对宿主细胞的毒性；2.融合蛋白的C端有酸水解位点，有利于用低成本的方法去除融合头；3.融合蛋白分泌细胞表达以避免包涵体形成并促进纯化。本发明的技术方案是：一种融合蛋白与阳离子抗菌肽的平端连接方法，其特征在于包括以下核苷酸序列：3a . SEQ ID: NO 1；B. SEQ ID:NO 2。根据权利要求1、2和3所述的DNA片段，其特征在于，通过使用融合蛋白X来增强表达的稳定性，并且所述片段的负电荷能够抑制阳离子抗菌肽的毒性。根据权利要求1、2和4所述的连接片段，其特征在于，其表达产物在融合蛋白和抗菌肽之间具有酸水解位点，有利于G13的分离纯化，便于工业化生产。大肠杆菌重组质粒该技术方案基于阳离子抗菌肽的正电荷是其生物活性所必需的科学原理，有助于抗菌肽分子与细菌细胞膜或核酸分子等靶标的结合。利用融合表达，融合头中的酸性氨基酸可以抑制目标抗菌肽对宿主细胞的毒性；添加酸水解位点可以以极低的成本通过化学方法除去融合蛋白。分泌型细胞表达，省略了细胞分裂的步骤，避免了细胞内含物如内毒素的释放，有利于下游的分离和纯化。技术效果1。稳定表达：带净负电荷的融合蛋白抑制抗菌肽对宿主的毒性，使融合蛋白能够稳定表达。2.融合蛋白分泌细胞表达，细胞中基本没有靶产物。3.酸水解位点的引入使得以低成本的方式通过酸水解获得目标产物成为可能。具体实施方式1:基因扩增：根据密码子偏好合成抗菌肽基因，向下游引物添加酶切位点和保护碱基；融合蛋白的上游引物添加有酶切位点和保护碱基，两个片段通过聚合酶链反应技术扩增。2.连接平端，用T4 DNA连接酶连接两个聚合酶链反应产物，并加入聚乙二醇(聚乙二醇4000)以提高连接效率。3.获得目标片段大小：双酶切连接产物，用胶回收目标片段预期大小的琼脂糖电泳条带。4.克隆和转化：目标片段经双酶消化后与质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞。5.诱导表达：选择正确的克隆，摇瓶培养基因工程菌至对数生长期，然后加入诱导剂诱导。6.分离纯化：诱导上清液酸水解，用阳离子交换树脂吸附，洗脱，得到阳离子抗菌4肽。第二，实施例2和实施例2以合成的抗菌肽G13序列为模板，上游引物添加了DP氨基酸序列，下游引物添加了终止密码子、eCORI切割位点和保护碱基。引物如下：G13F:5 -Gatcacgcgttctg-3 ，G13R:5 -GGAATTCTTACTAGATC-3 。反应条件：95955min，9430s，5530s，7230s，25个循环，7210min。用1.5%琼脂糖电泳检测聚合酶链反应产物，用试剂盒回收G13片段。以含有融合蛋白X的保守质粒为模板，上游引物添加Nco切割位点和保护碱基。引物如下：XF:5 -CCCATGGATGGCAAAAGC-3 ，XR:5 -AAGGGTTTCCGA AGGGCTtggc-3 。反应条件：95955min，9430s，6030s，7230s，25个循环，7210min。用1%琼脂糖电泳检测聚合酶链反应产物，用试剂盒回收X片段。G13片段和X片段在其平端与T4 DNA连接酶连接。连接条件：两个片段各5L，10个配液缓冲液2L，50%聚乙二醇4000溶液2L，T4 DNA连接酶1L，ddh2o5 l。酶在22灭活1h，在65灭活10 min。使用1%琼脂糖电泳检测并切割凝胶以回收目标片段。用上游引物X和下游引物G13扩增连接片段X-G13、Nco和EcoR。条件为：聚合酶链反应产物10L，10缓冲液Tango 4L，核酸内切酶各1.5L，ddH2O 13L.37孵育4h，65灭活20min。酶消化产物通过试剂盒纯化，然后与载体连接。转化大肠杆菌BL21(DE3)的感受态，包被LB(Amp+)平板，选择单克隆菌落进行聚合酶链反应验证，测序。同时，使用1摩尔IPTG的最终浓度来诱导蛋白质的表达。seq id : no1 x seq id : NO2 gatccgcagcgtttctgtctaacgcactcgttgtgtgtgtgctgttcgttgaaseq id : NO3融合蛋白SEQ ID: NO 4 DPQRS