抗体工程制药PPT演示课件.ppt

第六章抗体工程药学，高秀荣，药学院药学系，第1节，第1、2、1节概述，基本概念，1，抗体(Ab)，是指机体免疫细胞被抗原激活后，由B淋巴细胞增殖分化产生的浆细胞产生的免疫球蛋白，能特异性结合相应的抗原。主要分布在血清、组织液和外分泌液中。即具有免疫功能的球蛋白，其可以与相应的抗原特异性结合。3，2，免疫球蛋白(Ig)，具有抗体活性或化学结构类似于抗体的球蛋白。由于结构不同，可分为五种类型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE5。免疫球蛋白是结构和化学的概念，而抗体是生物学和功能的概念。4，3，抗原(Ag)，一种能刺激机体免疫系统产生特异性免疫反应并能在体内和体外与相应的免疫反应产物(抗体)特异性结合的物质。抗原有两个基本特征，一个是诱导免疫反应的能力，即免疫原性，另一个是与免疫反应的产物反应，即反应性。完全抗原简称为抗原。它是一种具有免疫原性和反应性的物质。例如，大多数蛋白质、细菌、病毒和细菌外毒素都是完全抗原。不完全抗原，即半抗原，是一种具有免疫反应性但无免疫原性的物质。如多糖、青霉素、磺胺和花粉。半抗原与蛋白载体结合后，获得免疫原性。表位是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。也称为抗原决定簇。抗体工程药物是指通过基因工程、细胞工程和转基因动植物技术生产抗体药物的过程。目前临床上使用的抗体药物和肿瘤治疗药物的应用存在“敌我不分”的问题，即杀死肿瘤细胞的同时破坏人体正常细胞。“生物导弹”为解决这个难题提供了一个理想的途径。“生物导弹”是指在将各种毒素、放射性同位素和化疗药物与识别肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗体偶联后，能够特异性杀死肿瘤细胞的一类药物。该药物通过静脉注射入人体，药效分子对肿瘤细胞产生强烈作用，从而提高疗效，减少对人体的毒副作用。放射性同位素和抗体的结合物可以将前者转运到体内的药物靶位，并通过其放射性活动杀死靶细胞。器官移植排斥的逆转在进行器官移植时，某些抗体药物可用于逆转器官移植引起的排斥。例如，抗CD3单克隆抗体，一种首次被批准(1986年)进入美国市场的治疗性抗体药物，被用于逆转肾脏、心脏和肝脏移植的排斥反应。目前正在开发和投放市场的抗体药物主要有以下用途：1 .器官移植排斥的逆转；2.肿瘤免疫诊断；3.肿瘤免疫成像；4.肿瘤导向疗法；5.哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心肌梗死、脓毒症、多发性硬化等自身免疫性疾病；6.抗独特型抗体被用作治疗肿瘤的分子肿瘤疫苗。随着抗体工程的发展，1937年通过电泳将血清分为白蛋白、a型、b型和丙种球蛋白，证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分中。1975年，科勒和米尔斯坦首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，这使得特异性和均一性抗体的大规模制备成为可能。通过基因工程技术制备人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体技术的发展经历了三个阶段：第一代：抗血清多克隆抗体；第二代：由B淋巴细胞杂交瘤技术制备的杂交瘤单克隆抗体；第三代：基因工程抗体。13、多克隆抗体(polyclonalantibody，pAb)，天然抗原分子通常含有多种抗原决定簇，这些抗原决定簇刺激机体，机体内的一些B淋巴细胞被激活，产生的抗体实际上含有针对多种不同抗原表位的抗体，是多克隆抗体；动物脾脏中有数百万种不同的B淋巴细胞系，不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。多克隆抗体的生产工艺。当机体受到抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活每个B细胞。活化的B细胞分裂并增殖形成浆细胞。大量浆细胞合成并分泌大量抗体分子，这些抗体分子分布在血液和体液中。获得多克隆抗体的方法：用动物免疫血清免疫的恢复期患者血清、免疫人群血清、动物抗血清的优缺点、从动物血清中提取抗体主要克服了人血浆来源有限的限制。然而，动物源性产品都有潜在的风险，如过敏和传染性病原体的传播。多抗体各向异性不高，容易发生交叉反应。解决单克隆抗体特异性低的理想方法是特异性抗体针对单个表位的单克隆抗体。单克隆抗体(mAb)如果可以选择血浆细胞进行培养，可以获得由单细胞(即单克隆)分裂和增殖形成的细胞群。单克隆细胞将合成针对抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体(mAb)。单克隆抗体的概念，问题：浆细胞在体外寿命短，难以培养和扩增。我们做什么呢1975年，科勒和米尔斯坦融合了以下两种细胞：能产生抗体但寿命短的B细胞，具有长寿命的骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞，22，单克隆抗体制备过程，23，每个杂交瘤细胞由一个B细胞和一个骨髓瘤细胞融合，并且仅合成和分泌针对单个表位的特异性抗体，即单克隆抗体。优点：结构单一，特异性强，交叉反应少。问题：从动物脾B细胞获得的单克隆抗体(即鼠源性抗体)对人具有很强的免疫原性，并将产生人抗鼠抗体(HAMA)。单克隆抗体被修饰以产生基因工程抗体。基因工程抗体(gAb)是通过基因工程技术获得的抗体，即通过聚合酶链反应技术获得的抗体基因与载体重组并导入表达系统以表达产生的抗体。优点：不仅保持了单克隆抗体的均一性和强特异性，而且克服了其作为鼠源抗体的不足。简而言之，基因工程抗体就是将人抗体的编码基因克隆到真核或原核表达系统中。体外表达人源化抗体的根本出发点是解决抗体的小鼠来源问题。第2、28、2节抗体分子的结构和功能，第29、1节抗体的结构，第30、1节基本结构，由214个氨基酸残基组成的轻链，具有25kD的相对分子量，并且同一抗体分子上的两个L链总是相同的。重链由450570个氨基酸组成，相对分子量约为5070kD。每个氢链包含一个由4-5个链内二硫键组成的环状肽，呈球形。可变区(V区)和恒定区(C区)，V区：靠近N末端轻链的1/2片段和重链的1/4或1/5片段的氨基酸组成和排列顺序是可变的，分为VL和VH。C区：靠近C端轻链的1/2片段和重链的3/4或4/5片段的氨基酸组成相对恒定，分为CH1、CH2和CH3。可变区意味着不同抗体中该区域的氨基酸序列不同。恒定区是指在不同的抗体中，该区域的氨基酸序列是相同的。在高变区(HVR区)和骨架区(HVR):在变区，某些特定位置的氨基酸残基表现出更大的可变性。它们一起形成抗原结合位点，该位点可以与空间结构中的抗原决定簇形成精确的互补。也被称为互补决定区，它们分别被称为互补决定区1，互补决定区2，互补决定区CDR3。可变区：可变区中氨基酸残基发生变化的部分它含有大量的脯氨酸，具有弹性，易于拉伸和一定程度的扭曲，有利于与抗原表位的互补结合。功能区1。通过折叠抗体功能区中的多肽链形成的球形结构域称为功能区。每个功能区由大约110个氨基酸组成，具有不同的生物学功能。每个功能区的功能性VH和VL共同形成抗原特异性结合位点。补体结合位点通过CH2、38和(3)水解片段穿过胎盘屏障。免疫球蛋白分子的某些部分在一定条件下容易被蛋白酶水解成各种片段。常见的蛋白酶包括木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。获得Ig酶解片段极大地促进了Ig分子结构和功能的研究，也为各种基因工程抗体的构建奠定了基础。例如，随着DNA操作和抗体修饰技术的发展，人们可以根据抗体水解片段的结构和功能关系产生更多功能性的Ig修饰分子片段。39，1。木瓜蛋白酶水解免疫球蛋白分子可产生两个抗原结合片段(Fab)和片段化片段(Fc)。Fc片段相当于两条重链的CH2和CH3功能区。它通过二硫键连接，可以形成晶体。它没有抗原结合活性，但具有固定补体和结合Fc受体的功能。Fab片段包括完整的轻链和部分重链(VH和CH1)，能特异性结合抗原并具有单价抗体活性。Fab片段可以通过基因工程获得。胃蛋白酶水解免疫球蛋白分子可产生1F(ab)2和几个裂解的小分子片段(PFc)。f(ab)2包含两条略大于Fab片段的L链和H链，它们通过二硫键连接并具有二价抗体活性。抗体的功能(1)V区识别和结合抗原的功能(2)C区激活补体系统以介导免疫细胞活性穿过胎盘和粘膜的功能(42)单克隆抗体的制备(43)第3节主要分为以下步骤：(1)抗原的制备动物的免疫抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞杂交瘤细胞的选择性培养和筛选单克隆抗体的大量制备(44)单克隆抗体技术的基本原理，B淋巴细胞可以产生抗体，但不能在体外进行无限分裂；尽管肿瘤细胞可以在体外无限期传代，但它们不能产生抗体。通过融合两种细胞获得的杂交瘤细胞具有两种亲代细胞的特征。下列细胞存在于两种类型的融合细胞中：未融合的单核亲代细胞(脾和肿瘤细胞)、同型融合的多核细胞(脾-脾，肿瘤-肿瘤融合细胞)、异型融合的双核细胞(脾-肿瘤融合细胞)，46、杂交瘤细胞用HAT(H为次黄嘌呤，A为氨基蝶呤，T为胸腺嘧啶核苷)培养基进行筛选。HAT在杂交瘤细胞筛选中的原理。在哺乳动物细胞中，合成DNA前体有两种不同的方式：从头合成：可被氨基蝶呤阻断的补救合成：需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或胸苷激酶(TK)的存在。骨髓瘤细胞系：从头合成途径被甲阻断；它是指在培养基中不能用h和t来完成脱氧核糖核酸的合成和死亡。抗原和免疫(1)抗原的制备(1)天然抗原的提取和纯化，以及通过蛋白质分离和纯化技术将蛋白质分子分离为抗原。对于低含量蛋白质，分离纯化成本高，目前很少使用。利用基因工程技术制备重组蛋白抗原可以获得足够的蛋白抗原。原核系统只能提供具有连续氨基酸表位的抗原。真核细胞和哺乳动物细胞系统可以解决抗原构象表位，但产量低，成本太高。根据抗原蛋白的氨基酸序列，合成肽半抗原是人工合成的抗原表位的多肽片段，即多肽半抗原。该方法效率高、成本低，已成为抗原制备的主要来源。半抗原：一种具有反应性但无免疫原性的物质。它能与抗体或致敏淋巴细胞特异性结合，但不能单独诱导免疫反应。小分子半抗原抗生素(青霉素等。)、杀虫剂、重金属等。属于小分子h多肽半抗原和小分子半抗原与载体如牛血清白蛋白(BSA)等偶联。(2)动物与免疫免疫免疫的目的是使B细胞在特定抗原的刺激下分化、增殖和分泌特定抗体。1。动物选择，一般采用与骨髓瘤供体免疫相同品系的动物。常用的骨髓瘤菌株来自Balb/c小鼠和卢大鼠，而免疫动物也采用相应的菌株。Balb/c小鼠，53，2。免疫学方法，包括体内、体外和脾脏。体内免疫适用于免疫原性强、抗原量大的患者。体外免疫体外免疫是指正常脾细胞和抗原在一定条件下体外共培养，然后与骨髓瘤细胞融合。体外免疫法，分离小鼠脾细胞或淋巴细胞。加入适量滋养层细胞和抗原，用37度5% CO2培养3天。体外免疫方案的免疫效果不如其他方案，仅用于抗原量少、抗原免疫原性弱的抗原。对于不能使用体内免疫的情况。脾内免疫小鼠麻醉后，打开腹腔，沿脾长轴方向缓慢注射0.1-0.2毫升可溶性抗原，免疫后3-4天取脾细胞融合。目前，最常用的方法是体内免疫。乳化，佐剂(弗氏佐剂)经常被加入以增强免疫原性。对于初次免疫，抗原需要与一定量的弗氏完全佐剂混合，并在乳化后使用。为了增强免疫力，可以使用不完全佐剂或不使用佐剂。弗氏完全佐剂由油(石蜡油或植物油)、乳化剂(羊毛脂或吐温)80和灭活的分枝杆菌(卡介苗)组成。对免疫系统有较强的刺激作用，免疫系统被认为是外界物质的作用。可以刺激免疫系统做出反应。弗氏不完全佐剂，仅石蜡油和羊毛脂，缺乏弗氏灭活结核分枝杆菌佐剂。弗氏完全佐剂用于初级免疫刺激。弗氏不完全佐剂用于增强免疫力。乳化，用佐剂包裹抗原形成油包水乳剂。乳化方法包括研钵研磨、机械搅拌等。体内免疫途径，皮下、腹膜内和静脉注射(大量抗原)。皮下、皮内和足底注射(抗原较少)。身体免疫后，药物被吸收到血液中。62，5。免疫程序，初次免疫(Ag100-500ug加弗氏完全佐剂注射液)，二次免疫(与上述剂量相同，加弗氏不完全佐剂注射液)，强化免疫(融合前免疫)，无菌脾收集，脾细胞制备，三次免疫(与上述剂量相同，加弗氏不完全佐剂注射液)，4周后，4周后，5-7天采血，抗体滴度检测，2周后，3天后，63，细胞融合和杂交瘤细胞选择。细胞融合是两个或多个细胞融合成一个细胞的过程。免疫动物的脾细胞骨髓瘤细胞=杂交瘤细胞。所需细胞：免疫动物的脾细胞、骨髓瘤细胞和饲养细胞。细胞1的制备。免疫脾细胞是指处于免疫状态的脾脏中的B淋巴细胞。增强免疫后3天取脾脏制备B淋巴细胞。此时，脾脏体积是正常小鼠的两