ELISA的原理ppt课件

.,1,酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）,.,2,ELISA的基本原理,使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。,.,3,用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析。,.,4,免疫标记,定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC异硫氰酸荧光素，PE藻红蛋白免疫酶测定法：HRP辣根过氧化物酶，AP碱性磷酸酶,.,5,免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,.,6,酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法（IndirectELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（CompetitiveELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体,.,7,酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA),.,8,酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA),.,9,酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA),.,10,ELISA的试剂,ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液,.,11,.,12,标本的采取和保存,体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。未抗凝血标本离心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温（2025）放置3060min，血标本可自发完全凝集，析出血清；或37水浴2030min，析出血清。以3000r/min转速离心510min，使血清分离完全。若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，并且不易洗去，可与酶标记物非特异性结合，造成假阳性。,.,13,标本的采取和保存,（1）要注意避免出现严重溶血、脂血标本。血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高，则其很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应，从而产生非特异性显色。脂血标本血清中大量的脂质小粒易黏附于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如乳化剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干扰。,.,14,标本的采取和保存,（2）血清标本宜在新鲜时检测，要注意尽量避免细菌污染。血清标本如在冰箱中保存过久，IgG可发生聚合，AFP可形成二聚体，使本底加深，产生假阳性反应。细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶可对以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。,.,15,标本的采取和保存,（3）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不均，应上下颠倒轻缓混匀，避免气泡，不要在混匀器上强烈振荡。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰冻保存。,.,16,试剂的准备1.放冰箱内保存的试剂、在使用前应先恢复到室温。2.仔细检查试剂各组分是否变质。3.保存试剂的冰箱应定期检查其贮存温度（正常为2-8），并尽量避免冰箱频繁开关。4.试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。5.ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。,.,17,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。1严格按照说明书要求，按规定的量和顺序进行。2使用的微量加样器应注意保养并定期校正。3加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出现气泡。加样前要看移液器的液面是否平齐。4加样时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。5加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。6.如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，避免污染整条甩掉再重新加。,加样:,.,18,温育,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。注意3点：1严格按照说明书要求，按规定的温度和温育时间进行。2为避免孔内液体蒸发，可用封板胶将ELISA板面密封后进行温育。3温育时尽量少开启恒温箱门，不能人为缩短或延长温育时间。,.,19,洗涤,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：,.,20,（1）流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。,（2）浸泡式微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。,.,21,显色HRP的底物DH2+H2O2ED+2H2O上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm，是HRP结合物最常用的底物。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(ureaperoxide)。,.,22,.,23,.,24,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMB（四甲基联苯胺）受光照的影响。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。不使用过期显色剂，肉眼可见浅兰色的TMB显色剂不能使用。显色剂避免在空气中暴露时间过长。加显色剂尽量避免溅出孔外。37度避光显色。,.,25,比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。结果以光密度（oplicaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。,.,26,酶标比色仪,酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。操作时室温宜在15-30，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。,.,27,6结果判断,定性测定,定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。,.,28,4.ELISA的操作要点,严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。,.,29,ELISA的优点：血清学方法有很多种,如传统的琼脂扩散(AGID)、血凝抑制(HA/HI)、乳胶凝集、试管凝集、补体结合等方法，但这些方