pcr的发展历程PPT课件

.1，PCR的发展过程，2，PCR技术的基本原理PCR:聚合酶链反应。1983年美国科学家KaryMullis获得了1993年的诺贝尔奖。PCR技术是模拟体内DNA复制，选择性地在体外扩增DNA特定区域的技术，包括变性、退火、扩张3个阶段。3，模板DNA的变性：模板DNA加热到约93 后，释放模板DNA双链或PCR扩增形成的双链DNA，将其制成单链，与引物结合，准备下一轮的反应；模板DNA和引物的退火(复性):模板DNA通过加热变成单链，然后温度下降到约55 ，引物与模板DNA单链互补序列相结合。引物的扩展：DNA模板-引物节点以dNTP为原料在TaqDNA聚合酶作用下，根据模板、基本对和准保守复制原理，扩展了模板DNA链的新的半保存复制链重复循环变性-退火-3过程，得到了更多的“半保存复制链”，这种新链可以成为下一个循环的模板。完成每个周期需要2-4分钟、2-3小时，就可以将将要扩展的目标基因扩增扩大到数百万倍。4，标准PCR反应系统：10放大缓冲液10ul4种dNTP混合物每种200umol/L引物各10 10100pmol模板DNA 0.1 2 ugtaqdna聚合酶2.5uMg2 1.5mmol/L加双或3蒸气-，5，PCR的发展史1985年，美国PE-Cetus的人类遗传研究室的Mullis等发明了划时代的聚合酶链反应。1988年初，Keohanog改用了利用T4DNA聚合酶的PCR，DNA片段非常均匀、可靠，只有一种DNA片段是预期的。但是每次都要添加新的酶。1988年，从温泉分离的水生热菌中提取的耐热DNA聚合酶(如Saiki)，使PCR的广泛应用成为可能。第6，第1代：手动/机器人水箱基因扩增用的3个恒温水箱，每个3个水箱的温度固定为3个温度。PCR的高温变质温度(例如94)低温复性温度(例如58)，柿子温度膨胀温度(例如72)。再用一个装有PCR标本的试管篮子，用手在各种温度的水浴箱中依次进行水浴。这种方法的特点是实验者的劳动强度高，疲劳容易出错。设备简单，投资少，与自动化基因放大设备相比，无需提高冷却过程，实验时间短，实验更接近理想的PCR反应条件。第7，2代：自动控制型PCR，特征：广泛使用，具有代表性。用琼脂糖电泳分析PCR产品。但是操作麻烦，只适合定性研究，交叉污染危险很大。第8、3代PCR:实时荧光定量PCR，为了避免上述传统PCR的缺陷并定量分析基因表达水平，1992年诞生了所谓的“第3代PCR”荧光定量实时PCR。Real-timeQ-PCR技术是指在PCR反应系统中添加荧光基因，利用荧光灯光信号积累实时监控整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定型和定量分析的方法。9，数字PCR的最终分析结果取决于Cq值，因此在这种意义上，所谓的“定量”是相对的。低辐射目标分子，模板浓度差在细微的条件下，检测的灵敏度和准确度受到限制。在此背景下，“数字PCR”应运而生。数字PCR是核酸分子绝对定量技术。数字PCR与实时荧光定量PCR相比，能够直接计数初始样本的绝对量DNA分子数。因此，特别适用于依赖Ct值不能很好地区分的应用领域，如拷贝数变