荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B的含量.ppt

荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量,实验目的,学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。,实验原理,常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。,a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。,激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。,激发光谱,发射光谱,常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。,a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。,仪器部件,维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。,维生素B2溶液在430440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525nm。VB2的荧光在pH=67时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。,实验预习,预习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。了解荧光光度计的操作步骤和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。,970CRT荧光光度计（上海分析仪器总厂）5mL吸量管1只，2mL吸量管1只，50mL容量瓶7只10.0gmL-1VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR），多维葡萄糖粉试样,仪器与试剂,1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长=440nm，发射波长=540nm。3.样品测定。4.退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。,基本操作,1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：在六个干净的50mL容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00、2.50和3.00mLVB2标准溶液，各加入2.00mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。2.未知试样的测定:称取0.15-0.20g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入50mL容量瓶中，加2.00mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。,实验步骤,1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2.根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上