转基因植物及其产品检测-质量控制与标准物质应用

转基因植物及其产品检测质量保证与标准物质应用,金芜军中国农业科学院生物技术研究所2010-05-06，杭州,主要内容,一、PCR检测质量保证二、核酸检测标准物质三、标准物质在转基因检测中的应用四、国内外转基因植物及其产品检测标准物质五、标准物质的使用六、标准物质管理,PCR检测质量保证,基本概念：质量保证（qualityassureance，QA）（实验）室内（部）质量控制（internalqualitycontrol，IQC）（实验）室间质量评价（externalqualityassessment，EQA）准确度（accuracy）偏差（bias）精密度（precision）,重复性条件（repeatabilityconditions）批（run）均值（mean）标准差（standarddeviation，SD或s）变异系数（coefficientofvariation，CV）正态分布（gaussiandistribution）,室内质量控制与室间质量控制,室内质量控制（IQC）：人员批内及批间重复性结果可靠性和有效性；即时评价室间质量控制（EQA）：第三方机构：农业部科技发展中心；农业部系统其他质检机构；质检系统；JRC；GIPSA准确度；不同实验室结果可比性操作与方法；回顾性评价,精密度与准确度,均值、标准差与变异系数,测定值的分布,质量保证：IQC与EQA,确定检测目的、内容采样准备采样分样样品运输、保存送样,样品接收、编号样品检测检测结果的有效性仪器设备的有效性试剂的质检,结果分析判读报告,管理决策,采样,检测,报告,IQC,EQA,QA,检测前质量控制,实验室环境与仪器设备管理实验室环境,仪器设备及材料管理,仪器设备维护及校准天平、移液器、定量PCR仪离心管质检：防污染；定量PCR吸头，tips：防污染日常核查：灰尘、细菌，其他实验材料；前次反应产物,日常核查要点,试剂质量,核酸提取试剂：尽量简化步骤，降低试剂污染概率PCR扩增试剂引物、探针：纯度，“错误序列”；特异性缓冲液、dNTP：KCl/NaCl；Mg2+；dNTP平衡且在20-200mol/LTaq酶：比活性20U/pmol试剂贮存：PCR，-20；提取试剂，2-8试剂质检内外包装性能抗干扰,操作程序,检测过程涉及多个环节：采样、样品保存、制备、试剂配制、核酸提取、PCR扩增、产物检测、结果分析、报告每一环节都会产生变异过程引起的变异，每一步骤变异总和：,主要污染源,样品本身实验室其他实验材料上次检测残留物环境,主要防污染措施,严格分区、单向流动化学清洁：10%次氯酸钠；70%乙醇扩增产物修饰：不能干扰正常扩增检测扩增前修饰：紫外照射，环丁嘧啶二聚体、嘧啶6，4-二聚体等；尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG），前次扩增用dUTP代替dTTP，后次反应前UNG处理反应管扩增后修饰：使扩增产物不能作为下次扩增的模板,质控数据评价,阳性质控样品失控（假阴性）原因：随机误差仪器试剂预防措施：核酸纯化重复与平行的设置样品稀释使用内质控（internalcontrol，IC）,假阴性原因分析流程,阴性质控样品失控原因与预防,原因：污染措施：防污染,假阳性结果分析流程,室间质量评价,EQA方案，样品设计与准备：5-8份组合报告格式：统一报告内容：清楚、简洁方法：统一方法；与日常检测方法一致总结：方法、试剂、仪器评价：特异性、灵敏度、符合率EQA报告：及时,核酸检测标准物质,应用历史主要应用范围转基因植物及其产品检测标准物质概况：IRMMAOCS农业部出入境系统,标准物质,具有一种或多种足够均匀和很好地确定了特性，用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质用最接近真值的接受参照值，作为统一量值的计量标准可保存、传递信息和量值本身是一种物质或材料；而不是一种器具或装置是计量标准的一种形式，要通过检定并正式批准，具有确定的检定数据和证书，具有一定的法律地位必须在规定条件下具有高稳定的物理、化学或计量学特性标准物质的保证值：,与标准物质相关的一些概念,标准物质（referencematerial，RM）有证标准物质（certifiedreferencematerial，CRM）测量标准（measurementstandard）一级测量标准或一级标准（primarymeasurementstandard或primarystandard）二级测量标准或二级标准（secondarymeasurementstandard或secondarystandard）工作测量标准或工作标准（workingmeasurementstandard或workingstandard）国际标准（internationalstandard）,国际约定校准物质（internationalconventionalcalibrationmaterial）溯源性或计量学溯源性（traceability或metrologicaltraceability）测量程序（measurementprocedure）测量方法（methodofmeasurement）国际约定参考测量程序（internationalconventionalreferenceprocedure）国际测量标准或国际标准（internationalmeasurementstandard或internationalstandard）,测量不确定度（uncertaintyofmeasurement）国际单位（internationalunits，IU）决定性方法（definitivemethod）参考方法（referencemethod）质控品（controls）稳定性（stability）均匀性（homogeneity）基质效应（matrixeffect）互通性（commutability）国际单位制(InternationalSystemofUnits,SI),核酸检测用标准物质的溯源关系,转基因检测中的“核酸”不能直接用物理或化学方法测定，所以没有传统意义的一级参考测量程序和一级标准物质核酸检测可以有：国际标准物质、国家或地区标准物质、实验室内部的工作制剂病毒检测：临床检验标准物质英国国家生物学标准物质和质控物研究所，NIBSC转基因检测国际标准物质？,量值溯源,溯源到国际基准（SI）：做不到溯源到方法：标准方法；先有标准方法还是先有标准物质溯源到人工标准：合成核酸？,核酸检测一级参考测量程序的替代方法,为了在不同实验室间的统一测量程序，可以为核酸检测建立所谓“参考测量系统”，包括三方面内容：参考方法参考物质参考实验室,核酸检测标准物质种类,基质质粒基因组DNA合成核酸序列,标准物质在转基因检测中的应用,检验校准标准或测量工作标准方法评价：符合度、不确定度检测校正：统计学意义的质量控制；检测结果的回溯；质量评价和质量控制能力测试质控结果：不可能进行重复测定仲裁：不同实验室检测结果不一致,PCR检测标准化,试剂方法的标准化,工作程序的标准化,标准物质（校准品）,具有可比性的可靠结果,传统理化检测与转基因检测中标准物质的使用,采样，处理,保存,样品制备,检测鉴定或定量检测,求值,评价,采样，处理,冷却，保存；4或-20,DNA提取纯化,定性PCR或定量PCR,检测结果与标准物质或其他参照物比较,结果判定,定性参考物质,定量参考物质,标准物质,核酸检测中的量值传递（质粒或合成DNA标准物质）,以一种材料的特性值来校准另一材料统一特性的值取决于适合的标准物质及其在检测程序中的可代替性标准物质的特征值与被测量一致具有足够大特性值，可以稀释成方法工作范围的不同浓度对特定检测目的的可代替性/适合性已得到证明稳定性和均匀性经过验证,方法评价,要点：特异性灵敏度符合度注意事项：统计学方法全面：方法、试剂、实验室水平严重误差产生的原因其他方面：检测的干扰因素,偏离的估算,偏离的估算是方法评价的重要指标，标准物质可为方法偏离估算提供必要信息：认定值，不确定值在限制范围内经认定的由方法引起的不确定值对标准物质的要求标准物质类别（基质）在方法测定范围内标准物质浓度在方法工作范围内不同浓度标准物质，最好能涵盖方法的所有测量范围,标准物质作为工作标准,最广泛的用途，工作曲线不同实验室使用相同标准物质，保证结果可比性方法研究中的标准曲线：自制内部参考物质制作标准曲线选择几个点，标准物质作外部参考物质,评价检测结果的可靠性,平均值的置信区间（U）公式：用标准物质的U来判断结果的可靠性标准物质与样品平行测定如果标准物质的分析结果与标准物质证书上的AU一致，表示样品检测结果可靠公式：,检验仪器的可靠性（精密度、准确度）,确定仪器处于正常运转状态用测定实际样品的操作方法和程序测定标准物质测定结果与标准物质保证值一致，表明仪器正常运转尽量使用纯标准物质：质粒标准分子、基因组DNA、合成DNA序列,国内外转基因植物及其产品检测标准物质,IRMMAOCS出入境检验检疫局重大专项,标准物质的使用：选用原则,1、对特定检测目的的适用性，包括对基质效应、量值间隔、不确定度的要求：被测量值测量区间（浓度）基质匹配性及可能的干扰因素样品量大小均匀性和稳定性测量不确定度,2、证书的有效性及不确定度的值3、标准物质及其生产者的以往记录，包括：是否进行实验室间比对（定值）是否使用不同检测方法进行了检验是否有其他实验室应用的成功经验4、标准物质证书及研制报告内容5、标准物质的研制与定值程序是否符合相关标准,根据用途选择标准物质方法建立与评价,方法建立的步骤：方法研究方法实施方法验证方法性能监测使用标准物质确定方法的不确定度、特异性和灵敏度,方法校正（定量方法）,一般仅纯物质标准物质可用于测量阶段的校准质粒分子或基因组DNA可用于校正标准物质作为内部控制，用于确定检测过程中样品的损耗、污染、干扰及其对应的不确定值当待测样品与标准物质特性高度相似时，可用基体标准物质进行方法校正同一来源的标准物质一次仅能用于一种目的；不能使用同一来源的标准物质同时进行方法校正和检测程序评估,质量保证与质量控制,实验室长期质量控制：评价方法或检测人员的性能（检测水平）、变化对标准物质的要求：均匀性、稳定性、特性值,能力测试,均匀性：保证分发到各实验室的样品相同稳定性：在运输、保存、检测过程中的稳定性；能力测试持续的时间,实验室间比对,稳定性：实验室间比对必然涉及样品的分发传递标准物质的均匀性：保证不同实验室间的结果仅由方法的重现性,身份确认与质控结果,特性值标准物质的准确度应比被测样品预期达到的准确度高3-10倍如欧盟要求对1%转基因含量的期望分析结果准确度在50%以内，则所选用的标准物质的准确度应在5%-17%之间,标准物质使用注意事项,一般要求：在合格期内，有合格证书经过分析测试，证明性能符合要求使用新的批号时，必须进行对比测试分析测试的数据，必须进行归档，便于检查,定量检测标准物质测定值与认定值的比较：计算标准物质认定值的标准不确定度（UCRM）估算结果的测量不确定度（Um），可用重现性的标准差代替计算二者联合不确定度确认2*UC是否大于认定值与测量值的差是，则结果可接受,实验室内部参照物,商品化供应标准物质无法满足实验室需要，建立内部参考物质非常必要。注意事项：选择合适的原料均匀性测试制备与分装（均匀性、污染控制、稳定性）稳定性测试特征值研究不确定度计算文件归档及质量保证保存及稳定性监测,标准物质管理,一、标准物质来源标准品作为计量物质应由权威法定机构提供，列入标准物质目录建议：对进口转基因植物可要求其提供有证标准物质二、标准物质保管应有专人负责标准物质管理标准物质到货后，管理员应检查验收并及时填写接收及使用记录，记录内容包括：编号、品名、批号、来源、数量、购进日期、领用数量、领用日期、领用人、结余、备注,三、标准物质存储、领用基体标准物质-70长期保存或按产品说明书指定条件保存质粒标准分子-70或按