蛋白质电泳的方法及显色方法.ppt

一维蛋白质电泳的方法及显色方法,辉骏生物：,1:一维蛋白质电泳方法的分类（1）:SDS-PAGE（2）:CTAB-PAGE（3）:酸-尿素连续PAGE（4）:Tricine-SDS-PAGE（5）:NativePAGE2：凝胶染色方法（1）：有机燃料类（2）：荧光探针类（3）：金属离子结合类,一维蛋白质电泳的方法及显色方法,辉骏生物：,简介：SDS是一种阴离子表面活性剂.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS后,由于SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。,1:一维蛋白质电泳方法SDS-PAGE,辉骏生物：,1:一维蛋白质电泳方法CTAB-PAGE,简介：SDS属于阴离子去垢剂，在低温下会结晶，某些情况下还会使蛋白质聚集或沉淀，而其有些蛋白质在SDS凝胶中不能很好的溶解或者出现异常的迁移现象。而CTAB属于阳离子去垢剂，可以很好的避免上述问题，如果样品没有经过煮沸和外加还原剂，一些经CTAB电泳系统分离的蛋白质仍然保持其酶活性。,辉骏生物：,1:一维蛋白质电泳方法酸-尿素连续PAGE,简介：非常适合研究同一蛋白的微小结构变体（有细微的电荷差别）或修饰后的形式（例如磷酸化，乙酰化等）。而SDS-PAGE难以将大小相似而电荷不同的两种蛋白分开。,辉骏生物：,1:一维蛋白质电泳方法Tricine-SDS-PAGE,简介：Tricine-SDS-PAGE适用与肽类的电泳，用tricine代替了甘氨酸可以分离小到500Da的肽类，适合SDS-PAGE肽图谱以及制备氨基末端，羧基末端测序的样品。,辉骏生物：,（5）:NativePAGE非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。,1:一维蛋白质电泳方法Native-PAGE,辉骏生物：,通常用来与蛋白质非共价结合并使之显色的标记物大致分为几类：（1）：有机燃料类。如考马斯亮蓝，利用吸光度检测。（2）：荧光探针类。如Sypro染料和尼罗河红，通过荧光检测。（3）：金属离子结合类。该类又可分为两类。一类是通过与不同盐结合而显色（如使用锌-咪唑染料进行复染或反响染色）另一类是利用金属离子的还原反映而被检测到，如银染。,2:染色方法,辉骏生物：,1:传统考马斯亮蓝R250(CommassieBlueR-250,CBR-250)染色CBR-250是一种有机染料，它通常能通过范德华力与NH3+的静电引力，与蛋白质形成紧密而非共价结合的复合物。与精氨酸和赖氨酸残基结合紧密，而与芳香族侧链亲和性稍低。2：快速考马斯亮蓝染色通过使用微波炉加速了CBR-250染色和脱色的过程，同时提高了灵敏度。3：InstaStainBlue凝胶纸染色通过使用一种含有考马斯亮蓝染料的纸将染料加到凝胶上去，这样就避免了操作液体染料时产生的问题，而且可以减少染色背景。,（1）有机染料类：,2:染色方法,辉骏生物：,（2）荧光探针类,有机染料在水溶液中不发荧光，单在非极性溶液中或者SDS-蛋白质复合物相连时,就会发处很强的荧光，通过荧光扫描仪检测。1：SYPRORuby荧光染色，SYPRORuby是一种过度金属有机复合物，直接通过静电作用与碱性氨基酸相互作用。2：SYPROOrange荧光染色。,2:染色方法,辉骏生物：,（3）金属离子结合类,银染：基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合的原理，主要实验步骤：固定，敏化，银液注入，显色，终止反映和图像固定。GelCode磷蛋白染色这种方法依赖于在钙离子存在时，用0.5mol/L氢氧化钠水解磷酸化蛋白质磷酸酯的连接。