基因工程-07-基因工程克隆方案设计

基因工程克隆方案设计，基因工程实验设计，1，目标基因的序列分析，2，载体的选择和分析，3，克隆策略的设计，4，引物的设计，目标基因的序列分析，1，ORF的分析：寻找待克隆的核酸序列，2，切割位点的分析：(1)切割位点为0的酶；可以通过引物添加以促进克隆；(2)具有限制性位点1和2的酶：用于基因和重组质粒的限制性克隆或限制性分析。向量的选择和分析，1。根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其他用途。2.多克隆位点是否有合适的限制性位点(通常，基因上没有限制性位点或一个限制性位点)3。表达载体应该注意表达框架的配对。4.载体的限制性位点用于重组鉴定。克隆策略的设计，1、平端克隆；(2)粘性末端克隆(1)TA克隆(2)单酶切非定向克隆(3)双酶切定向克隆、平末端克隆、机械中断、化学合成、EcoRV酶切或其它酶切位点末端修饰(克氏酶展平、S1处理)以产生平末端；克隆效率低，需要大量添加连接酶。载体需要脱磷；方向可以是正的，也可以是负的。TA克隆，1。将在由普通Taq酶扩增的聚合酶链反应产物的3末端添加一个A；2.公司提供的T向量的5端有一个粘性T；使用： (1)快速克隆聚合酶链反应产物：(2)基因测序(阳性或阴性)；(3)T-载体上的MCS用于调节下一个克隆步骤的切割位点。单酶切割不针对克隆，载体需要脱磷(否则，自连接效率极高，不能插入外源基因)；基因插入可以是阳性也可以是阴性，需要筛选。双酶切定向克隆，类型：(1)粘-粘连接：最有效和最快速的(2)粘-平连接：适用于外源基因与载体只有一个相同的酶切位点，而另一端可以被展平；(1)基因和载体都用两种酶切割；(2)连接效率高；(3)外源基因的插入方向是固定的，没有识别。(1)同一尾酶切下的两端与单酶切下的两端相同，相当于单酶非定向克隆。(2)载体MCS中的两个切割位点应该更远，以防止一端被不完全切割；(中间插入有其他基因片段的载体可被选择用于酶消化和回收制备)。初级设计，通用设计原则，特殊目的设计技巧，初级通用设计原则，1。长度：15 37 nt，一般20 nt左右；(仅绑定，无链接器)2。碳含量40% 60% 3。避免息肉或多嘧啶或回文对称结构；4.引物本身不能互补(20nt) Tm一般为55 80 55 58最佳在聚合酶链反应中结合温度T=Tm-5。特殊目的引物设计技术，1.5附加切割位点(定向克隆):2。引入点突变3。不确定序列4。聚合酶链反应产物的直接测序，5附加切割位点(定向克隆)，1。不同酶的不同保护碱基序列；网络目录提供相关信息。2。一些酶保护基含有其他切割位点。注意，引入了双切割序列： NDE 1 eCOR 1，点突变。1.一个引物可以引入多达3个点突变，这可以延长引物长度。2.突变位点应该靠近5端。3.应注意密码子偏好性、简并性和不确定序列(3 4种)。5 ATGGGCICCAICTTCTACC 3 ，表明1，次黄嘌呤核苷酸1可以与4个碱基配对。2.它可用于聚合酶链反应产物的直接测序。具有不确定的序列-(2种)，5 C3，描述：1，表明在该位点有两个可能的序列A或C；2.合成引物只需要一个引物的钱；实际上获得的是两种比例相等的引物的混合物：5at ggg