纤维素酶ppt课件

作者：刘洋，纤维素酶的发酵，简介：纤维素是世界上最丰富的天然高分子化合物，大部分是由绿色植物通过光合作用合成的。据估计，每年通过光合作用的纤维素更新量约为4.0X1010吨。纤维素是地球上最丰富的多糖物质，是植物细胞壁的主要成分，占植物秸秆干重的1/3 1/2，也是自然界中最可再生的生物聚合物。这取决于人们对纤维素酶的发现和理解。纤维素有巨大的潜力。世界农作物秸秆年产量超过20亿吨，仅中国农作物秸秆年产量就高达7亿吨。由于其含有大量的纤维素，营养价值低，畜禽难以利用，因此只有一小部分用作饲料，一小部分用于还田或直接还田，而约45% 47%用作燃料，以补充农村能源的短缺，15%以燃烧的形式被焚烧或丢弃。秸秆的直接利用率相对较低。如果这种纤维素废料得不到有效利用，不仅会严重污染环境，还会造成资源的极大浪费。因此，探索纤维素废弃物的处理方法并有效利用是21世纪的重大课题。纤维素的介绍结构什么是纤维素酶？纤维素酶：纤维素酶是一种在分解纤维素中起生物催化作用的酶。它是一个多组分酶系统，是具有纤维素降解能力的酶的总称。根据纤维素降解微生物与纤维素酶系的关系，纤维素酶系可分为三类：第一，可合成降解天然纤维素相对较弱但可大量分泌出细胞外的纤维素降解酶系统，且酶的组分是游离的，如普通木霉和青霉的纤维素酶系；其次，它具有很强的降解天然纤维素的能力，但分泌出细胞的纤维素酶的活性很低，如担子菌。第三，它具有很强的分解天然纤维素的能力，但基本上没有纤维素酶分泌到细胞外，如厌氧菌的纤维素酶系统。纤维素酶的组成和性质，1:外切葡聚糖酶包括两类酶，一类是-1，4-D-葡聚糖-葡萄糖水解酶，也称纤维素糊精酶(酶代码EC 3 . 2 . 1 . 74)；第二类：纤维二糖水解酶(纤维二糖水解酶)，即-1，4-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶(exo-B-1 B-1，4-D-4-D-葡聚糖酶，EC3.2.1.91)，缩写为核酸外切酶。CBH是纤维素酶体系的重要组成部分，在天然纤维素的降解中起主导作用。CBH可以水解微晶纤维素和棉花等高结晶度纤维素，作用于非晶纤维素的非还原端或还原端，水解-1，4-糖苷键，依次切断一个纤维二糖分子，生成可溶性纤维二糖和纤维二糖。2:内切纤维素酶(EG)或内切葡聚糖酶，即内切-1，4-d-葡聚糖q-葡聚糖水解酶(内切-葡聚糖酶，EC3.2.1.4)，称为内切酶，也称为cx酶、羧甲基纤维素酶。内纤维素酶立即水解磷酸膨胀纤维素、羧甲基纤维素和其他无定形纤维素的无定形区域，不规则地水解-1，4糖苷键以形成不同大小的葡萄糖、纤维二糖纤维三糖和纤维二糖，为纤维二糖水解酶提供更多可水解的末端。纤维素酶的组成和性质。3:-葡糖苷酶(-葡糖苷酶，-6或BG)或-D-葡糖苷-葡萄糖水解(EC3.2.1.21)，也称为纤维二糖酶(CB)，主要裂解纤维二糖和小纤维素糊精，以水解非还原端的葡萄糖残基，产生葡萄糖产物。其水解速率随着底物尺寸的减小而增大，当底物为纤维二糖时水解速率最快。严格来说，-葡萄糖苷酶不能算作纤维素酶，但它可以降低纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用。纤维素酶的组成和性质，纤维素酶的物理和化学性质。首先，不同来源和不同组分的纤维素酶的分子量差异很大，变化范围很大。目前，人们普遍认为：1。核酸内切酶的分子量为23-146 kda；(然而，一些研究认为核酸内切酶的相对分子量在23-118 kDa(胞内酶)和47-76 kDa(胞外酶)之间。2.真菌EG的两个异构酶，EGI的分子量为54千道尔顿，AEG的分子量为49.8千道尔顿。核酸外切酶的分子量在38 38 118 kDa之间，木霉菌产生的CBH1的分子量约为66kDa，CBHII的分子量为53kDa。13-葡萄糖苷酶为90 90 l00kDa(胞内酶型)和47 76 kDa(胞外酶型)。等电点是蛋白质分子的一个重要的物理和化学特征。纤维素酶体系中各组分的等电点随菌种来源和培养条件的变化而变化。一般认为木霉产生的CBHI的pI值约为4.2，CBHI二号的pI值约为5.9。真菌EGI的pI值约为4.7，EGUI的pI值约为4.8 5.6(也有报道约为7.47)，BG的pI值约为7.5 8.5。纤维素酶的物理和化学性质，3:最适温度酶促反应有一个最适温度。纤维素酶的最适温度范围一般为40-60。纤维素酶组分的热稳定性也有差异。内切核酸酶(Cx)的最适温度为50 60。它具有良好的热稳定性，在95仍保持一般的酶活性。不同来源-葡萄糖苷酶的最适温度为50 60。然而，有研究报道-葡萄糖苷酶具有耐高温性，在50下60h仍保持95%以上的活性，最适温度为70。据报道，康宁木霉核酸外切酶(C1)具有特殊的热稳定性，其最适温度为40 60。纤维素酶的最适ph值纤维素酶的最适pH值对环境pH值非常敏感。纤维素酶的最适pH值因菌株和组分的不同而不同。例如，由曲霉属、青霉属和木霉属产生的酸性纤维素酶在酸性环境(pH 4.0 5.0)中通常具有较高的活性。田新宇从200多株嗜碱细菌中筛选出一株产碱性纤维素酶的菌株N6227，酶反应的最适pH值为8.5。核酸内切酶的最适pH值为5.0 7.0。C1酶和血糖的最适pH值约为5.0，血糖在pH 4.0 8.0范围内稳定。(5)纤维素酶产生微生物的多样性通常不仅仅具有一种类型的纤维素酶组分。实验证明，粉状链球菌培养液中含有5种内切葡聚糖酶和2种不同的血糖。绿脓杆菌的胞外酶包括三个BG、四个cx和五个核酸外切酶。即使只产生一种类型的纤维素酶组分，通常也有许多不同的形式。埃琳娜。s等报道了一种白热担子菌(phanerochaetechrysosporium)根据碳源可以在细胞外、细胞内和细胞壁上产生三种不同的BG，它们相应的相对分子量分别为96kDa、98kDa和114kna。由于不同的区域来源和不同的培养条件，同一微生物可能具有不同的纤维素酶组分，这也是纤维素酶多样性的表现。嘿。纤维素酶的理化性质，6:诱导型真菌纤维素酶纤维素酶是一种诱导型酶，它只能在诱导剂存在下产生。许多不溶性纤维素、可溶性纤维素衍生物、一些低聚糖和一些单糖和二糖可以用作纤维素的诱导剂。尼斯扎瓦研究发现纤维素、纤维二糖、槐糖、纤维二糖衍生物等。可以诱导里氏木霉和绿色木霉产生纤维素酶。然而，值得注意的是，低分子可溶性糖如纤维二糖和葡萄糖在低浓度时具有促进作用，而在高浓度时开始抑制。当然，对于不同的微生物，相同的浓度和物质可能有不同的甚至完全相反的效果。纤维素酶的作用原理和纤维素酶降解纤维素的位置优先发生在无定形区的理论已被普遍接受。根据这一理论，首先内切纤维素酶作用于纤维素分子内的无定形区域，然后水解-1，4-糖苷键，截断纤维素分子以产生大量末端不还原为纤维素的小片段，然后外切纤维素酶，也称为纤维二糖水解酶，作用于纤维素线性分子的末端，水解-1，4-糖苷键，一次切断一个纤维二糖分子。最后，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。纤维素酶发酵过程纤维素酶分布广泛，主要来自三个来源：1。微生物来源：主要包括霉菌和担子菌等真菌木霉、黑曲霉、青霉和根霉是最活跃的真菌，而细菌包括绿色木霉和球形芽孢杆菌。2.动物来源：从反刍动物瘤胃液中制备纤维素酶粗酶制剂；生物工程来源：迄今为止，已从40多种细菌和几种真菌中克隆出纤维素酶基因，并构建了这些酶的基因库。同时，通过基因工程方法对纤维素酶分子进行修饰，以提高其活性和耐受性。培养基：选用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)代替茶培养基中的蔗糖，其余配方不变；种子培养基为0.75%羧甲基纤维素钠、0.5%蛋白胨、2%吐温80、0.03%硫酸镁、氯化钙、H2O、微量硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、氯化钴、自然酸碱度；发酵培养基为0.75%羧甲基纤维素钠，(NH4)2SO4，2%吐温80，其余与种子培养基相同。弃去染料溶液，加入适量的lmol/L氯化钠溶液，洗涤1小时。如果菌体能分泌纤维素酶，菌落周围会出现一个清晰透明的水解圈，根据透明圈与菌落直径的比值大小来选择产酶菌株。2.还原糖的测定采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)。3.滤纸酶(FPase)活性的测定：在试管底部预先放置一张合适大小(约50毫克)的滤纸，加入1毫升样品和1.5毫升柠檬酸-硫酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH5.0)，在50下保温1小时，扣除背景，测定反应后还原糖的含量。酶活性定义为在上述条件下每小时催化生成1g葡萄糖的酶量为1g。菌种选育：收集的土壤样品用无菌水冲洗后，取上清液进行梯度稀释，选择培养基涂以适当的浓度，选择几个菌种，纯化并保存。在选择培养基中采用刚果红染色法进行复筛，筛选出4株纤维素水解能力强的菌株，在液体培养基中发酵，测定纤维素酶活性，选择酶活性最高的菌株进行保存。纤维素酶发酵工艺：固体发酵工艺1固体发酵工艺的特点：固体发酵工艺，也称为麸曲培养法，以秸秆粉、废纸和玉米秸秆粉为主要原料，与种曲混合，放在平板或窗帘上，铺成一薄层(约1cm厚)，在培养室内一定温度和湿度(RH90%至100%)下进行发酵。其主要特点是发酵系统中没有游离水，微生物在湿度足够大的固体基质上反应，发酵环境接近微生物在自然状态下的生长习性，生成的酶系统更加完整，有利于天然纤维素的降解，具有投资少、能耗低、产量高、操作简单、回收率高、无泡沫、所需控制参数少、环境污染小等优点。然而，固体发酵容易被杂菌污染，产生的纤维素酶难以分离纯化，色素不易去除。纤维素酶发酵技术2固体发酵设备浅盘发酵罐是一种常用的固体发酵设备。培养基灭菌冷却后装入浅盘中，用空气加湿器调节发酵空间的温度和湿度，工业化程度较低。固体发酵设备的发展趋势是机械化发酵罐，特别是流化床固体发酵设备，发酵效果会更好。3.固体发酵过程，4.固态发酵过程条件固态发酵过程中的温度、湿度、时间、湿度、酸碱度等因素及其相互作用对发酵有显著影响，温度是外围发酵的主要因素。培养基和培养条件的优化是降低酶制剂成本、提高酶活性和实现工业化生产的重要措施。一般认为真菌固态发酵最好是将培养基的初始酸碱度调节到酸性，这有利于真菌的生长并抑制细菌的生长。固体发酵培养基的初始含水量应根据荆德兵等人采用均匀设计U15(58)和双温培养法(第一个30h为30，随后为27)。结果表明，在自然供氧、培养基自然pH值(约6.5)和环境湿度约60%的条件下，康宁木霉固态发酵产纤维素酶的适宜发酵时间为72h。徐福建等提出了一种纤维素酶气相双动态固态发酵方法：在最佳条件下(最佳压力脉冲范围、脉冲频率和气体内循环速率)，发酵温度控制良好，910cm高填料层的最大温度梯度为0.12s/cm；以蒸汽爆破秸秆为底物，发酵水的活性得到了很好的保持。动态培养发酵周期(60h)比静态发酵周期(84h)短1/3，酶活性(20136国际单位/克)是静态酶活性(10182国际单位/克)的两倍。压力脉动下，固态培养物的上、下、中层微生物生长条件均匀、松散，而固态发酵层中间几乎没有菌体生长。利用气相双动态固态发酵可以为纤维素酶的大规模生产奠定基础。纤维素酶发酵法，液体深层发酵法2-纤维素酶1液体深层发酵法的特点液体深层发酵法又称全发酵法，它是将秸秆等原料粉碎、预处理、灭菌，然后送至带有搅拌叶片和通风系统的密闭发酵罐中，接种菌种，用强无菌空气或自吸气流充分搅拌，使发酵的气液面积最大化。其主要特点是培养条件容易控制，杂菌不易污染，生产效率高。深层发酵是现代生物技术之一，已成为国内外重要的研发过程。纤维素酶发酵技术液体深层发酵设备液体深层发酵一般采用带搅拌叶片的菌体生长和曝气系统。利用气相双动态固态发酵可以为纤维素酶的大规模生产奠定基础。3.液体深层发酵工艺，纤维素酶发酵过程，4。液体深层发酵工艺条件液体发酵时间约70h，温度一般低于60。液体发酵的接种量明显低于固体发酵，接种量的浓度一般为2%-10%(v/v)。张东延等研究了绿色木霉AS.3.3711、康宁木霉AS.3.2774、康宁木霉AS.3.3032和康宁木霉ACC.3.167产酶的适宜发酵条件。曾庆兰等人研究了丝状真菌赤霉酸产生纤维素酶的条件。结果表明，当接种量为5%，培养时间为120h，培养温度为28 37，培养基初始pH值为5 6时，产酶量达到最佳值。优化了绿色木霉纤维素酶AS3.3032的固态发酵条件。将1.1菌株绿色木霉(TrichodermavirldeAS3.3032)的原始菌株转移到麦芽汁琼脂斜面培养基中。1.2产酶培养基的原料：麦麸、汽爆蔗渣和稻草粉，过60目筛备