载体构建的基本步骤_第1页
载体构建的基本步骤_第2页
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文档简介

载体构建一、原则根据限制性核酸内切酶、DNA连接酶及其他修饰酶的作用，分别适当地剪切和修改目的基因和载体DNA，然后连接到宿主细胞，在宿主细胞内准确地表达目的基因。二、工作阶段1、摇菌(受体细胞初步制作)拿两个装有液体培养基的3ml试管(视情况而定)，在每个试管中放入40-100l菌株，摇晃一整夜。2，质粒(即矢量)按照质粒套件上的说明(根据情况的最后阶段，可以再洗1-2次)。3、酶切(双酶切产生粘性末端)反应所需的试剂体积(单位：ul)质粒10需要的内切酶反应缓冲液2所需的限制恩多纽克莱亚第一H2O 7在37 放置1-2h的隔热层。(按照酶解的特定阶段；为了达到最佳的酶效果，最好根据选择的酶来确定所需的反应温度)4、电泳检测用琼脂糖凝胶电泳检测酶切成功与否。回收胶：琼脂糖和缓冲液一对一胶，切割回收目的产品和目的产品精制功能；测试胶：琼脂糖及缓冲液1比2制胶，以测试目的，条带是否符合预期。粘合剂回收与产品精制几乎是相同的过程，达到相同的目的。粘合剂回收也是精制过程。如果不是目的片段，可以用回收工具包精制非常不纯的DNA溶液。产品精制是进一步去除更纯的DNA溶液中额外的杂质，使用精制套件，你会发现精制套件和回收套件的步骤基本相同。5、矢量和目标基因连接电泳检测酶成功完成后，小心地切下所需的片段，回收胶体(按照胶水回收工具包说明书操作)。然后连接回收的碎片和托架。放置在温度框中，12-16，绝缘8-16h6、转基因(连接产物转化为受体细胞)按照具体操作步骤进行减刑，对上述连接产物进行转换实验，涂色板培养，37 ，12-16h。7、单克隆检测(1)复制挑库单首先从冰箱里取出AMP，然后在3毫升有LB液体培养基的试管里3L，直到融化AMP，用枪混合；取5个1.5 mlEP管(有时可以选择多个管)，在每个管上添加500L以上培养液，然后使用接种环(或黄色枪头)进行单克隆、拾取，然后用枪飞；之后，将选定的菌摇晃4-5个小时，使其混浊即可。(2)单克隆检测以每一种摇晃的菌液为模板，用原引物进行PCR，然后用电泳运行PCR产物，观察电泳图像的那几管束带是否正确，将正确排好该管的菌液放入100L (LB液体培养液，AMP)试管中，整夜摇晃。第二天再摇晃，从1.5mlEP管中提取1ml，保存种子。注：选择单克隆时，必须选择单个圆的群体，不要选择有卫星斑点的群体。别忘了在徽章上加AMP。接种迷幻菌后，在酒精灯上反复点火，然后进行下一次酒精菌。三、注意事项1.连接产品可以在-20 储存短时间，使用时去除，并进行后续实验。2.细胞变形的时候，冰浴和热冲击等要好好调节时间。3.连接反应是DNA重组过程的关键阶段，成功或失败的重要参数之一是温度，需要控制制造连接温度。4.黏稠端连接时，会产生一定数量的载体本身的环化分子，转化菌
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