基因工程概论.ppt

,基因工程,华中师范大学陈明清,参考书：,基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社基因工程，彭银祥，李勃，陈红星，华中科技大学出版社。基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社。基因工程原理，徐晋麟，陈淳，徐沁主编，科学出版社。分子克隆实验指南，J.Sambtook,EFFrish,TManiatis,金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。基因工程，楼士林等编著，科学出版社,基因工程,第一章导论第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的载体第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表达第六章基因工程的基本技术第七章转基因动植物,第一章导论,第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的成就和前景展望,细胞的发现,1859年物种起源,进化论的提出,MendelG.J.(1822-1884).1856-1864豌豆杂交实验。,Mendel和遗传规律的研究,1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律,1909年YohannsenW.L.(1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遗传因子”的概念。,基因概念的提出,1910年以后，MorganT.H.等提出了基因的连锁遗传规律，染色体遗传理论发展为细胞遗传学,连锁遗传规律的提出,1941年，BeadleG.W.等证明了基因通过酶起作用，提出了“一个基因一个酶”的假说,一个基因一个酶,一般认为1973年是基因工程诞生的元年上世纪40年代70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。,第一节基因工程的诞生,1944年，AveryO.T.利用肺炎双球菌转化实验,1、DNA是遗传物质被证实,40年代，证实DNA是遗传物质早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和组蛋白构成，但组成蛋白的氨基酸有20种，而组成DNA的核苷酸只有4种，什么是遗传物质？1928年，英国微生物学家F.Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。（1）S型：注射小白鼠，死亡。（2）S型，65加热：注射小白鼠，活。（3）R型：注射小白鼠，活。（4）65加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。,40年代，DNA是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。（1）S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。,Watson和Crick,2、DNA双螺旋模型的提出,50年代，DNA的双螺旋模型的提出和DNA复制机理的阐明,DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。1953年，FrancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。,分子遗传学的诞生,Nireberg等为代表的一批科学家,3、“中心法则”的提出,60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）,既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。,原核生物的基因调控操纵子模型,1961年，JacquesMonod和FancoisJacob提出了原核基因调控的操纵子模型（operonmodel）。,一般认为1973年是基因工程诞生的元年上世纪40年代70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。,第一节基因工程的诞生,Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，Boyer等相继发现了coRI一类重要的限制性内切酶。,1、工具酶的发现和应用,1967年，世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。,1、工具酶的发现和应用,1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使真核基因的制备成为了可能。,2、反转录酶的发现和应用,1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组；,3、载体的发现及其应用,1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。,3、载体的发现及其应用,Cohen等的重组实验示意图,Tcr,Ner,基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化,第一节基因工程的诞生,一般认为，1973年是基因工程诞生的元年。上世纪40年代70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。,第一章导论,第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的成就和前景展望,生物工程biologicalengineering遗传工程geneticengineering基因工程geneengineering分子克隆molecularcloning基因克隆genecloning基因操作genemanipulation重组DNA技术recombinantDNAtechnique克隆（clone）,与基因工程相关的几个概念,什么是克隆（Clone）作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的工程。所以，植物的无性繁殖（如马铃薯的生产）、细菌的无性繁殖以及重组DNA分子通过工程菌的繁殖等过程都是一个克隆的过程。那么，克隆动物是怎么回事呢？基因工程的概念一般来说，基因工程是在体外将目的DNA（来源可以是动植物和微生物）和某一载体（DNA）系统进行重组，再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。,基因工程研究的基本步骤,1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段）2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA分子。3、将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。4、选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增。5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。,基因工程的基本流程,基因分离酶切,载体酶切,基因和载体连接,导入细菌,重组质粒繁殖,重组克隆的选择,序列分析和基因表达等研究,基因工程研究的主要内容,基因工程研究的主要内容基础研究:basicresearch克隆载体研究:cloningvector受体系统的研究:hostcellsystem目的基因的研究:targetgene生物基因组学的研究:genomicresearch应用研究:application,第一章导论,第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的成就和前景展望,基因工程的兴起,1977年，激素抑制素的发酵生产成功。Itakara等，化学合成的激素抑制素基因和大肠杆菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重组质粒，并通过大肠杆菌生产出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，经溴化氰处理后释放出了有生物活性的激素抑制素。首次实现了真核基因的原核表达。用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质，这相当于50万头羊脑的提取量。1978年，Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。1979年，Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。1980年，Nagata等，遗传工程菌生产干扰素获得成功。1981年，用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。1982年，重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。1983年，基因工程生产狂犬病疫苗取得突破型进展。,利用转基因猪器官进行猪灵长类异种移植,1997年，动物基因工程产品销售额约,1.8亿$,转基因小鼠,人类秃顶,NatureBiotechnology,1999,17(1):9,转基因家蚕,防弹衣,NatureBiotechnology,1999,17（5）：412,8384858687888990919293949596979899000102,Firsttransgenicplant,Delay-ripeningtomatoCommercializedintheUS,Firstfieldtests,Herbicideresistant,insectresistantplantscommercialized,GMmaizeapprovedbyEU,FirstBtcornplants,RottingresistanttomatoapprovedbyFDA,植物基因工程的发展迅速,ApartfromSomeMinorEffects,ThingsAreLookingVeryPromising!,制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。,1.对环境的影响,2.新型病毒的出现,重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。,一、基因工程的安全隐患,基因工程的安全性,将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。,4.人造生物扩散,新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。,3.癌症扩散,1.公众的担忧,二、重组DNA研究的安全准则,1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请PaulBerg博士组成一个重组DNA咨询委员会。,这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。,2.专家的态度,3.制定安全规则,1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。,规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。,分4级：P1P4级。,（1）实验室的物理安全,4.基因工程的安全措施,一般装备良好的普通微生物实验室。,P1级实验室,P2级实验室,在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。,全负压的实验室，同时装备安全操作柜。,P4级实验室,专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。具有最高安全防护措施。,P3级实验室,在自然环境中无法存活。,（2）实验室的生物安全,分3级（大肠杆菌）：EK1EK3级。,EK1级的大肠杆菌,在自然环境中一般都要死亡。,EK2-EK3级大肠杆菌,第一个“安全”菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。,（3）载体的安全,应该是失去了自我迁移的能力。,不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。（容易构建）。如pMB9，pBR322等。,一、基因工程在农业生产中的应用,1.提高植物的光合作用效率,基因工程的应用,改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（1）提高CO2的固定率,改变光能交换系统的分子的基因结构。,（2）提高光能吸收率和转化率,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。,2.提高豆科植物的固氮效率,是农业生物技术的主要内容。是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。,3.转基因植物,世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）,中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）,将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。,4.转基因动物,在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的转基因小鼠；分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。,二、基因工程在工业中的应用,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,1.纤维素的开发利用,2.酿酒工业,三、基因工程在医药上的应用,1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,Genentech的骄人业绩,制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）,2.用微生物生产药物,3.技术设计高效高特异性的生物制剂,4.研制疫苗,1.用转基因植物或动物生产药物,大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等,应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂,美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）,1,中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）,6.法医鉴定,7.基因治疗,5.基因诊断,将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。,（仍在探索阶段）,医药,药物基因组学,人工设计,克隆P450s,疾病的动物模型,治疗性小分子,植物,微生物,诊断用蛋白,治疗性蛋白,微生物,动物,疫苗,植物,微生物,治疗性核酸,基因治疗,基因修复,反义药物,DNA疫苗,诊断性核酸,遗传病,传染病,用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。,四、基因工程在环境保护中的应用,1.检测水污染,2.生物降解,用重组细菌或转基因鱼等检测水污染,生物技术的发展在某种程度上是由商品经济的发展所推动的。,Genentech公司1980年上市后20分钟内由35$涨到89$/股。,一、商业投资支持现代生物技术研究,基因工程技术的商业化发展,1980-1983年，美国成立了200多家生物技术公司。1985年400多家，1300多家。现在几乎每个大跨国公司（化学和制药）都投巨资。,二、基因工程商业化特点,1.技术密集型,（1）产品来源于实验室,Boyer教授是Genentech的副总裁。,（2）科学家往往就是公司的领导人,1994年仅美国的总销售额40多亿美元。1992年日本4000亿日元。20世纪末6000亿美元。,2.市场扩张迅速,美国1993年40多亿美元。日本1997年5000多亿日元。80年代初，加拿大联邦政府出资参与建立的Allelix生物技术公司，注册资本高达一亿美元！,3.投入巨大,4.风险太高,前期的资金投入是极其巨大的，非一般企业所能承受。,我国在“七五”和“八五”计划的10年间，仅就“基因重组人生长激素”一个项目的研发就先后投入了近1.5亿元人民币的经费。这仅仅是一个仿制型的二类新药，而且又仅仅是制药工艺的研发。长达10余年的研发过程，巨额资金的投入，最终也并未获得高质量的“国产二类新药”。,全世界只有不超过100家生物技术公司有自己的产品。其中真正盈利的公司很少。,制药，动物胚胎移植技术，转基因动植物，农作物新品种等。,已取得的成果中60%是医学领域的。,7.医学生物技术产业进展最快,6.研究专一、产品专一,8.专门为基因工程实验提供研发试剂的公司,5.产品不断增加,我国基因工程部分研究进展,转基因抗病虫植物我国科学家将抗虫基因导入棉花，获得了抗虫植株，对棉蛉虫的抗虫效果十分显著，现正进行田间加代繁殖。抗黄矮病、赤霉病、白粉病转基因小麦和抗青枯病马铃薯也已研究成功，开始田间加代繁殖。基因工程疫苗乙型肝炎是危害我国人民健康的严重疾病，我国乙肝病毒携带者1亿1千万人，其中40左右的慢性肝炎可能发展成为肝硬化和原发肝癌。以往乙肝疫苗是从人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不仅有巨大的经济效益，而且有巨大的社会效益。基因工程乙肝疫苗是我国正式批准投放市场的第一种高技术疫苗，在20多项指标上达到国际先进水平，获国家科技进步一等奖。继乙肝疫苗之后，我国又研制成功了痢疾、霍乱等数种基因工程疫苗，并经国家批准进入临床试验。,基因工程药物干扰素是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤高技术药物，对防治病毒性肝炎和恶性肿瘤有重要的作用。现已有了3个品种的基因工程干扰素获得国家新药证书，开始大批量生产。除此之外，我国还研制成功了肝癌导向药物（生物炸弹）、系列恶性肿瘤辅助治疗药物等十余种基因工程