动物细胞培养技术.ppt

第三节细胞工程技术制药,1.动物细胞培养的实验室操作技术,2.植物细胞培养的实验室操作技术,一、细胞培养基本概念,从体内组织取出细胞，在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。可以是单个细胞，也可以是细胞群,二、细胞培养目的与用途,生物药物研究及生产新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。疫苗研究与生产：如病毒性疫苗的研究与生产（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。基因工程药物研究与生产：如干扰素研究与生产，细胞生长因子研究与生产等。细胞工程药物研究与生产：生物活性多肽研究与生产，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与生产。单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。,基础研究药物作用机理基因功能疾病发生机理,三、细胞培养设施和基本条件,实验室设计细胞培养室和设计原则：防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养工作包括：工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室,普通细胞培养一角,细胞培养区,普通细胞培养室内走廊,万级层流细胞培养室,常用设施及设备,超净工作台：净化工作台无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。分析间：显微镜、计算机及打印机等。,培养器皿,液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体。培养瓶：用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。培养皿：用于开放式培养及其它用途。吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。离心管：根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。,培养用品的清洗与消毒,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。对新使用和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法,培养用品的清洗与消毒,玻璃器皿的清洗清洗过程：浸泡、刷洗、侵酸和冲洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质,浸泡新的初次使用的玻璃器皿：玻璃表面带有大量灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。,浸酸清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。,清洁液配制的强度，常用的下列三种：强清洁液：重铬酸钾63g，浓硫酸1000ml，蒸馏水200ml次强清洗液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml弱清洁液：重铬酸钾100g，浓硫酸100ml，蒸馏水1000ml,配制过程注意事项配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色,冲洗冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用,胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸1020分钟，以除掉培养中的蛋白质。1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后煮沸1020分钟，晾干备用。,塑料制品的清洗塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。,消毒,常见的原因操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染,消毒,紫外线消毒对象：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不宜近照射也进行实验操作。,消毒,湿热消毒消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止意外事件发生。,消毒,化学消毒法最常见的是70%酒精及1的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。抗生素消毒主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。,四、动物细胞培养技术,原代培养技术动物细胞传代培养技术,原代培养技术,又称为初代培养，是指从体内取出组织接种培养一直到第一次传代阶段，一般持续l4周原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，最基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞培养法,1、组织块培养法,组织块原代培养过程,取材用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡盐溶液PBS或Hanks液漂洗；切碎用锋利的眼科弯剪将组织块剪成长1mm、宽1mm、厚0.5mm的小块；再用PBS液或Hanks液漂洗多次，直至液体不混浊、无油滴、清亮为止。,贴瓶用湿润的吸管吸取切碎的组织块，轻轻吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀摆放在培养瓶底壁上，量不要过多。要将组织块切面贴在培养瓶底壁上。,加营养液将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞,干固将种植了组织块的一侧朝上，静置于37培养箱中；培养待组织块贴壁lh3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没于培养液中，静置。每隔2天3天更换一次培养液，或者根据培养液颜色的变化确定换液时间,操作过程注意事项,组织块接种后的前3天，从组织块向外迁移的细胞数很少，组织块的粘附不牢固，在观察和移动过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动或振动，否则组织块不易附着在瓶壁上或附着后也会脱落漂起。加入的培养液不易过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来,操作过程注意事项,用组织块培养时，要及时观察，当发现细胞向外迁移出来后要记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。,操作过程注意事项,为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在接种前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。细胞培养过程中，胶原中的促细胞贴附因子先吸附于培养瓶底壁上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促细胞帖附因子的底壁附着。,、消化培养法,将妨碍细胞生长的细胞间质、纤维等用相关的消化酶除去，使细胞分散，形成悬液，易从外界吸收养分和排出代谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。,、消化培养法,悬浮细胞培养的两种形式体外培养这种细胞或微生物时，可以通过对培养液以及其中的细胞进行不断搅拌或者对培养器皿进行振荡、快速旋转而维持细胞的悬浮状态；一些细胞无需搅拌或用摇床摇动，只要在培养器皿表面涂上一层不利于细胞粘附的硅脂即可维持悬浮状态。,、消化培养法,原代培养贴壁培养过程,、消化培养法,制备细胞悬液：从动物胚胎或动物体获取脏器组织，剪成长1mm、宽1mm、厚0.5mm的小块，用胰酶消化分散，制备细胞悬液。调整密度：计数并用培养液调整细胞密度，用培养液稀释成21057105ml的细胞悬液。接种：分装入培养瓶或培养板内置37CO2培养箱中培养,、消化培养法,培养形式一：在培养器皿内放人一个有聚四氯乙烯包被的磁棒。将培养器皿封口，送人恒温箱内。在磁力搅拌器上边搅拌边培养形式二：细胞接种在培养瓶或试管内，封口后可将培养器皿固定在恒温摇床上，边摇动边培养，无需放置磁棒形式三：接种于预先用硅脂包被过的培养器内在培养箱中静置培养换培养液：培养液略呈黄色时换液。吸出部分旧培养液（一般为培养液的1/31/2），加人新鲜培养液即可,动物细胞传代培养技术,“传代培养”或“继代培养”组织细胞经过原代培养，细胞分裂繁殖，培养物逐渐增多长满培养空间，继而相互间接触发生接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止。需要将培养物分割，重新接种到培养瓶内进行再培养。这种将培养瓶中的细胞用胰酶消化下来，制成细胞悬液，再转接到两个或两个以上的培养瓶中培养。,动物细胞传代培养技术,组织块培养物的传代过程分离细胞培养物贴壁型细胞的传代过程分离细胞培养物悬浮型细胞的传代过程,、分离细胞培养物贴壁型细胞的传代过程,、分离细胞培养物贴壁型细胞的传代过程,分割培养物再次接种,、分离细胞培养物贴壁型细胞的传代过程,移液：取出培养瓶，打开瓶盖。用吸管吸出旧培养液。漂洗：用无Ca2+、Mg2+离子的平衡盐溶液轻轻漂洗培养物1次2次，洗去残余血清后弃去平衡盐溶液。消化：在培养器皿内加入胰蛋白酶溶液，室温下消化5min15min，显微镜下观察细胞突起缩回近似圆形、细胞之间间隙增大时停止消化。,、分离细胞培养物贴壁型细胞的传代过程,终止消化：用吸管吸去消化液后立即加人含血清培养液或蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶的活性。脱壁：用弯头吸管吸取培养器皿内的培养液反复吹打瓶皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶皿底壁。离心：低速高心，弃去上清液。计数：用新鲜培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度。传代：将细胞悬液接种到一个或多个新的培养器皿中。,、分离细胞培养物悬浮型细胞的传代过程,将培养物移入离心管低速离心。用吸管吸去上清液，加入新鲜培养液使细胞沉淀重新悬浮。根据传代目的将细胞悬液接种在一个或多个新的培养器皿中。加足培养液，加盖封口，放人恒温箱中继续培养,传代培养注意事项,离体培养的细胞生命力比较脆弱，传代时细胞没有生长到培养瓶底壁面积的80以前，不要急于传代对贴壁细胞消化后的吹打过程要有序进行，要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的四角处。确保瓶皿底壁各处的细胞都被吹打脱离。吹打时动作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。,传代培养注意事项,传代数是指对培养物传代的次数，它不等于细胞分裂的次数或细胞的代数，而仅代表传代操作的次数。传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并进行原代培养的程度。传代后的细胞生长不像刚开始原代培养时那样缓慢。传代对细胞生长和性状会产生不利影响，一般情况下要尽可能减少传代次数。,五、细胞污染的检监测与排除,微生物（细菌、真菌、支原体）化学因素（影响细胞生长而非细胞所需的化学物质）。,（一）生物污染的检测,细菌的污染及检测真菌的污染及检测支原体的污染及检测,细菌的污染及检测,细菌污染的种类及时间：在细胞培养中较多见的是大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单孢菌；多在传代、换液、加样操作后发生。细菌污染的检测方法及过程将10ml左右的细胞悬液以1000rmin离心5min，再用无菌的PBS洗涤2次，接种到无抗生素的培养基中，置于培养箱中，37条件下培养24h。如培养物真的受到污染，可见细菌生长。当污染的菌量较大或细菌繁殖到一定程度时，培养几小时之后增殖的细菌即可导致培养基外观混浊，在倒置相差显微镜下，可见培养基中有大量的细菌颗粒漂浮。,真菌的污染及检测,污染的种类：烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子菌、白色念珠菌、酵母菌等污染的检测：在倒置相差显微镜下可见丝状或树枝状的菌丝。这些菌丝呈白色丝状团块，如棉絮状，悬浮在培养基中或附着在培养器皿、培养物的表面污染的时机：真菌污染常见于在潮湿环境下使用培养板和培养皿等开放性培养系统。培养器皿外的污染物需及时用酒精棉球擦洗，以防止其传人培养系统内,支原体的污染及检测,支原体污染的表现：受支原体污染的培养系统不发生混浊，也无其它特殊的外观表现。如果在培养过程中用显微镜观察发现许多细胞发生破碎，而且培养细胞需频繁改变培养环境才能长期传代时，应怀疑培养系统是否受到支原体污染,支原体污染的检测方法,PCR（聚合酶链式反应）方法PCR方法是模拟自然状态下DNA分子的复制方式在体外实现DNA扩增。利用事先设计好的对支原体特异的rRNA基因引物或rRNA基因间隔区的引物，可以检测到培养系统中极其微量的支原体DNA，其敏感度非常高。,支原体污染的检测方法,荧光染色法原理：用能与DNA相结合的荧光染料对细胞进行染色，无支原体污染时，DNA只存在于培养细胞的核内，而污染了支原体的细胞，由于支原体附着在细胞的外表面，所以，在荧光显微镜下可见细胞周围或附着于细胞表面的绿色小亮点，而且亮点密度和支原体污染程度成正比。,支原体污染的检测方法,相差显微镜观察在培养器皿中事先放置一个盖玻片，把培养细胞接种于其上，24h后取出，将有细胞的一面朝下覆盖在载玻片上，用相差显微镜的油镜观察，在细胞表面和细胞之间的暗色微小颗粒，即为支原体,支原体污染的检测方法,免疫学方法利用人工制备的针对各类支原体的单克隆抗体，与培养细胞表面的支原体结合，再用荧光酶标记的针对支原体单克隆抗体的抗抗体，用间接免疫细胞化学染色法染色，阳性者即可认定存在支原体污染,支原体污染的检测方法,电镜观察取培养细胞，用扫描电镜或透射电镜观察，此方法即简便又快捷,（二）生物污染的排除,使用抗生素加温处理动物体内接种与巨噬细胞共培养,使用抗生素,确定培养物被污染后，可直接进行大剂量（5倍10倍的常规剂量）冲击用药用含药培养基处理24h48h后，再换常规培养基，有时可奏效，此法在污染的早期效果较好,加温处理,方法：将受支原体污染的培养细胞放置在41的水浴中作用5h10h，最长不超过18h，可杀灭培养系统中的支原体。策略：高温对细胞的生长也有较大影响，在实验前应先用少量培养细胞做实验以找出最合适的时间和温度，尽可能保证既杀死支原体又使细胞不致受到太大损伤。,动物体内接种,将被污染的培养细胞接种在裸鼠的皮下或腹腔，其可以接受人的肿瘤细胞形成移植瘤，而其体内的巨噬细胞和其它非特异的防御体系仍可消灭污染的微生物。等待一定时间后取出细胞