灭菌技术

李晖作,灭菌技术,广义的细菌即为原核生物是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区（nuclear region)（或拟核）的裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌（eubacteria）和古生菌（archaea）两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。,第一节 概述,根据人体对环境微生物的耐受程度，中国药典对不同给药途径的药物制剂大体分为两类：规定无菌制剂和非规定无菌制剂（即限菌制剂）。无菌制剂根据活微生物的制备工艺可分为灭菌制剂(灭菌工艺)无菌制剂-无菌制剂生产技术制备的制剂。,一、灭菌1、灭菌与灭菌法灭菌（sterilization）:系指用物理或化学等方法杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的过程。灭菌法:所用的灭菌方法称为灭菌法或灭菌技术。2、无菌和无菌操作法:无菌（sterility）：是指在任一指定物体、介质或环境中，不得存在任何活的微生物。无菌操作法（aseptictechnique）:系指整个操作过程控制在无菌条件下进行，使产品避免微生物污染的一种操作方法或技术。,二、无菌制剂 灭菌制剂:用某一物理化学方法杀灭所有活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂-过程可灭菌 无菌制剂:即无菌操作制剂,用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽孢的一类制剂-一些不耐热药物的注射剂,眼用制剂,vc等;,三、无菌制剂种类 药物制剂中规定无菌制剂包括：注射用制剂，眼用制剂，植入型制剂，创面制剂，手术用制剂，另外还有冲洗液，腹膜透析液和抗原提取物。,四、灭菌设备的选择灭菌柜 GMP对灭菌设备的规定：灭菌柜应具有自动检测、记录装置，其能力应与生产批量相适应等。,五、灭菌方法分类灭菌方法基本分为三大类：1、物理灭菌法（干热、湿热、射线、滤过）2、化学灭菌法（气体、化学杀菌剂）3、无菌操作法,第二节湿热灭菌,湿热灭菌法系指用饱和蒸汽、沸水或流通蒸汽或其他热力学手段进行灭菌的方法。一、湿热灭菌法分类 热压灭菌法 流通蒸汽灭菌法湿热灭菌 煮沸灭菌法 低温间歇灭菌法,热压灭菌法 用压力大于常压的饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。特点：效果好而可靠，能杀灭所有繁殖体和芽胞热压灭菌法范围：能耐高压蒸气的药物制剂、玻璃、金属容器等。 输液多用此法。一般可按如下灭菌条件进行选择： 115、68kPa、 30min 121、98kPa、 20min 126、137kPa、15min,2、流通蒸汽灭菌法指在常压下，采用100流通蒸汽加热杀灭微生物的方法。灭菌时间为：3060min3、煮沸灭菌法指待灭菌物置于沸水中加热灭菌的方法。煮沸时间为3060min,4、低温间歇灭菌法 指将待灭菌物品置于60-80的水或流通的空气中加热60min，杀灭微生物繁殖体后，在室温条件下放置24h，让待灭菌物中的芽孢发育成繁殖体，再次加热灭菌、放置、反复多次，直至杀灭所有芽孢。,二、湿热灭菌设备 湿热灭菌设备按工艺分为高压蒸汽灭菌器、快冷式灭菌器、水浴式灭菌器、回转水浴式灭菌器,高压蒸汽灭菌设备 卧式热压灭菌柜 立式热压灭菌柜 手提式热压灭菌器,1、高压蒸汽灭菌器,注意事项：必须使用饱和蒸气饱和的湿热蒸气潜热大，穿透力强必须将灭菌器内的空气排除表压=蒸气分压+空气分压有空气，热蒸气压就小灭菌时间的计算必须要正确时间必须是全部药液达到要求温度时开始计算一定要注意安全操作灭菌后，停止加热，关闭蒸气必须使蒸气压力降到0，锅内压力和大气压相等后稍稍打开锅门，冷却1015min，再全打开锅门，避免压差太大，温差太大而造成安全问题，或使物品冲击、玻璃瓶炸裂等,2、快速冷却灭菌器快速冷却灭菌器采用了先进的快速冷却技术，设备的温度、时间显示器符合GMP要求，具有灭菌可靠、时间短、节约能源、程序控制先进等优点，是广泛用于瓶装液体、软包装进行消毒与灭菌的设备原理:通过饱和蒸汽冷凝放出的潜热对玻璃瓶装的液体进行灭菌,并通过冷水喷淋,快速降温,灭菌温度,时间,冷却时间,温度可调.,结构原理,3、水浴式灭菌器用于安瓿瓶,大输液瓶等的灭菌高温水直接喷淋, 灭菌结束后冷却水间接冷却,三、影响湿热灭菌的因素,微生物的种类和数量药物性质和灭菌时间蒸气性质介质的性质,微生物的种类和数量微生物数量多灭菌时间长 耐热、压次序： 芽孢繁殖体衰老体,药物性质和灭菌时间灭菌温度愈高，灭菌时间愈长。药品被破坏的可能性愈大。原则：在达到有效灭菌的前提下，尽可能降低灭菌温度和缩短灭菌时间。,蒸汽的性质,蒸汽,饱和蒸汽,湿饱和蒸汽,过热蒸汽,热含量,热穿透力,灭菌效率,湿饱和蒸汽,过热蒸汽,饱和蒸汽,湿饱和蒸汽,过热蒸汽,饱和蒸汽,湿饱和蒸汽,过热蒸汽,饱和蒸汽,湿饱和蒸汽,过热蒸汽,饱和蒸汽,湿饱和蒸汽,介质的性质,四、灭菌工序质量检查,1、灭菌室温度检查温度均一2、细菌检查3、热原试验灭菌结束后对药品做热源试验,第三节.干热灭菌,在干燥空气（火焰或干热空气）中加热达到灭菌的方法火焰灭菌法：方法：在火焰上直接灼烧特点：简便可靠适用：瓷器、玻璃、金属制品,第三节.干热灭菌,干热空气灭菌法方法：高温干热空气灭菌，一般1801h以上特点：穿透力弱，温度不均匀，灭菌温度高适用：耐高温的玻璃、金属制品；不允许湿气穿透的油脂类材料和耐高温的粉末材料不适于：多数药品、橡胶、塑料制品,二、干热灭菌的原理 干热灭菌是指物质在干燥空气中加热可以破坏蛋白质与核酸中的氢键，导致蛋白质变性或凝固，核酸破坏，酶失去活性，使微生物死亡，达到杀灭细菌的方法。,方式:对流、传导、辐射 特点： 干热空气的比热容低，传导差，穿透力弱,温度分布不均,在干燥状态下微生物耐热,因而干热灭菌温度高,时间长。由于空气有分层去向故要加风机。,干热灭菌设备：电热层流式干热灭菌机远红外隧道灭菌化学灭菌技术无菌操作,四.干热灭菌设备,分类 间歇式干热灭菌设备,即烘箱. 连续式干热灭菌设备 热空气平行流,即电热层 流式干热灭菌机 远红外加热灭菌,即辐射式干热灭菌机,(一). 热风灭菌烘箱,电热层流式干热灭菌机原理： 采用的是热空气平行流的灭菌方式。常温空气经初效及中效过滤器后进入电加热区加热,高温空气在热箱内循环运动，充分均匀混合后经过高效过滤获得A (100) 级的平行流空气，直接对玻璃瓶进行加热灭菌，在整个传送带上，所有瓶子均处于热风吹动下，热量从瓶子内外表面向里层传递，均匀升温,然后直接对瓶子进行加热灭菌。,分三段-预热段、高温段、冷却段主要特点 (1)快、均匀、充分、无死角、无污染、时间短. (2)全过程自动控制 (3)符合GMP要求 (4)三段有独立的净化系统 (5)电加热分三组，以适应不同需要,工作流程：,洗瓶机,干热灭菌机,灌装机,预热,高温,冷却,洗瓶机,干热灭菌机,洗瓶机,干热灭菌机,洗瓶机,灌装机,干热灭菌机,洗瓶机,预热,灌装机,干热灭菌机,洗瓶机,高温,预热,灌装机,干热灭菌机,洗瓶机,冷却,设备操作 开始前检查工作检查各部件运行正常,附件完好运行工作自动化运行, 记录结束工作清理设备内残留物等 ;维护保养表:a空气排出管道安装抽风机;b设定温度不要超过350度;c;d;e;f;g;常见故障表(3-4 ):,辐射式干热灭菌机预热区 高温灭菌区 冷却区,高温灭菌区,水煤气等（发生器）在氧化钛等上燃烧能产生远红外线，(远红外线发生器)远红外线直接辐射到要灭菌的物理上（玻璃瓶）效率很高温度可达250 -350 度，一般350 度照射5min就可以灭菌,第四节化学灭菌技术与其他灭菌法,化学灭菌法系（Chemical sterilization technology）指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭，同时不损害制品质量的灭菌方法。常用的方法有气体灭菌法和化学杀菌剂灭菌法。化学杀菌剂的杀灭效果主要取决于微生物的种类与数量，物体表面光洁度或多孔性，以及杀菌剂的性质等。化学灭菌的目的在于减少微生物的数量，以保持一定的无菌状态。,一、气体灭菌法,气体灭菌法是用化学药品的气体或蒸气对药品、材料进行杀灭细菌的方法。常用的方法有环氧乙烷灭菌法、臭氧灭菌法、气化双氧水灭菌法及其他气体灭菌法。常用气态杀菌剂：环氧乙烷，戊二醛，甲醛，丙二醇，甘油，过氧乙酸,1、环氧乙烷灭菌法,能对细菌和芽孢有杀灭作用,使用浓度为850-900mg/L，45度维持3h或450mg/L，45度维持5h（1）环氧乙烷灭菌器；混和气（环氧已烷，二氧化碳、氟利昂）或纯气体（2）操作过程；充气-加热-在排除环氧乙烷（3）用途：适用热敏感（4）注意（毒性）（爆炸）,2、气化双氧水灭菌法,双氧水通过双氧水发生器气化；杀灭细菌、芽孢；35%浓度；灭菌温度4-80 无危害残留物（氧化性，被还原成水）微量锈蚀引起浓度下降对灭菌器材、被灭菌物要求高,3、其他气体灭菌法,臭氧、甲醛、丙二醇、乳酸、过氧乙酸的化学试剂熏蒸（室内通入蒸气，密闭一段时间 ， 维持一定湿度，温度，（防止冷凝）在排出，在除去室内剩余的灭菌气体）,二、药液灭菌法,药液灭菌法指用杀菌剂溶液进行灭菌的方法。适合用于皮肤，无菌器具和设备的消毒75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%-0.2%新洁尔灭（苯扎溴铵）、3%酚溶液及2%煤皂酚溶液。,三、射线灭菌法,射线灭菌法指用辐射、微波和紫外线杀灭微生物和芽孢的方法。1、辐射灭菌（1）辐射灭菌技术将最终产品的容器和包装暴露在由适宜放射源辐射的射线或适宜的电子加速器发出的射线中，达到杀灭微生物和芽孢的方法（2）机理：射线使有机物直接发生电离，导致微生物体内大分子化合物分解（3）特点：灭菌效率高，（4）缺点（费用高、降低药效、对人员危险）（5）用途（抗生素、维生素类）,2、微波灭菌 (1)微波灭菌法：用微波照射产生的热能杀灭微生物和芽孢的方法。产生300MHz300kHz之间的电磁波灭菌的设备（2）机理：利用微波的热效应使生物体内蛋白质变性失活；生物效应干扰微生物的新陈代谢，破坏微生物生长条件。（3）特点：穿透到介质内部1-6（4）用途：适合固态和液态物料灭菌，且对固体物料有干燥作用,微波可以杀灭各种微生物，包括细菌繁殖体、真菌、病毒和细菌芽孢、真菌孢子等,3、紫外线灭菌（1）紫外线灭菌法指用紫外线（能量）照射微生物和芽孢的方法。波长一般为200-300nm，灭菌力最强的波长是254nm（2）机理：紫外线作用于核蛋白使其变性（3）特点：对所有菌种都有效，灭菌对像无影响（4）缺点（5）用途,紫外线消毒法,四、过滤灭菌,过滤灭菌指用过滤技术除去微生物的方法（1）机理-细菌不能通过滤材（2）应用范围（3）滤过除菌的特点1.2.3（4）滤过除菌设备,第五节 无菌操作法,指整个过程都在无菌条件下进行的一、菌制剂操作室的清扫灭菌（1）甲醛溶液加热熏蒸法（2）紫外线灭菌（3）液体灭菌,清扫和灭菌方法,二、无菌操作,无菌操作室、层流洁净工作台、无菌操作柜是无菌操作的主要场所。,三、无菌制剂操作室管理,（1）人员（2）物品（进入） 安瓿和药水瓶 双扉门灭菌器 传递窗或室 无菌制剂操作室正压 空调夜间也运行,四、无菌操作室的定期检查,如温湿度、尘埃数、菌落数、风量、空气压力、杀菌灯、送风机和管道类、其他,五、无菌操作岗位人员培训要求,1、法规、规章、制度2、无菌基本概念3、无菌控制4、（SOP）训练5、组长岗位资质6、机修无菌概念培训7、无菌操作岗位的文件管理,第六节灭菌存在的问题及对策,一、灭菌的影响因素1、微生物致死机制2、灭菌与时间与温度、水分关系3、湿热灭菌与干热灭菌的比较4、决定灭菌全过程时间的因素5、与包裹材料有关6、与烘箱类型有关7、干热灭菌对物品的影响8、常用检测灭菌过程的指示器（热电偶、生物指示剂）,二、二次污染问题及解决办法,1、二次污染问题提高产品密封完好性及冷却阶段防污染措施 2、处方、工艺问题的改进 3、玻璃瓶及其他问题,三、灭菌干燥设备安放问题,1、小容量注射剂车间灭菌柜的安放2、洗灌封联动机安放,四、脉动真空灭菌柜常见故障及解决办法（湿热蒸汽灭菌设备）,1、常见问题（1）真空度问题（电磁阀质量）（水压问题）（2）包裹尺寸问题（3）排气系统（4）柜密封问题 2、有效的灭菌时间 3、湿包问题 4、包裹材质问题 5、灭菌柜验证,五、灭菌管理要点,1、使用微生物指示剂2、待灭菌物的微生物污染程度3、灭菌前后产品应有可靠区分方法4、应制定灭菌设备仪表的容许误差限度5、除菌前后检查装置及滤膜的完整性6、湿热121以上，温度和时间组合证实可靠即可7、流通蒸汽或真空排气、预热8、混合气体，应均一并验证9、预热和冷却时间尽量短10、冻干机应设在线清洗和在线灭菌设施,第七节湿热灭菌设备验证,一、设计的审查1、设计必须符合压力容器标准2、负载与生产能力适应3、灭菌监控系统4、腔内空气排出5、热静力式蒸汽疏水器6、具有门开启安全装置7、控制标准,二、灭菌工艺条件,1、热分布均匀2、灭菌药品的装载方式3、升温和冷却时间4、压力调节问题5、必须装仪表装置,三、热分布测试四、热穿透性试验五、对热敏感产品的灭菌六、生物指示剂将一定量