酵母双杂交系统.ppt

酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）,主讲人：MrQiu,主要从以下几方面介绍酵母双杂交系统,概念原理优点与缺点应用优化,酵母双杂交系统的概念,酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首次建立并得到广泛地应用。,酵母双杂交的原理,利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用使用不同的培养基筛选阳性克隆,双杂交系统的两个重要元件：转录激活因子：DNA结合结构域（DNAbindingdomain，简称为DB）和转录激活结构域（activationdomain，简称为AD）报道株：经改造的、含报道基因的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞。酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点易于转化、便于回收扩增质粒；具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因；酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。,酵母双杂交模型,DNA-BindingDomain,BaitProtein,PreyProtein,TranscriptionActivatingRegion,ReporterGene,DNA-BindingSite,模型,文库筛选的步骤,将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母再将文库质粒转化到酵母中通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白,序列分析,从酵母中分离质粒然后转化E.coli从大肠杆菌中提取质粒并测序在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性,质粒构建,在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的DNA结合域前面的多克隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因，Leu2,Ura3,orTrp1等。,实例：酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS（upstreamactivatingsequence，上游激活序列）报告基因的表达i.GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类基因的表达，这些基因的5-端存在UAS序列；ii.GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA结合域(DNA-bindingdomain,BD),C-端(768-881)具有转录激活结构域(transcriptionalactivationdomain,AD)。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录,iii.如果AD和BD分别与两个基因编码序列融合，且两种蛋白质能相互发生结合，就可导致GAL1-LacZ基因的表达。其中与AD融合的基因称之为钓饵基因，与BD融合的基因可称之为目的基因(即建立的基因文库)。为了提高报告基因的表达活性，LacZ基因还可以与HIS3基因融合在一起，只有当HIS3基因表达量足够大时，转化细胞才能在合成培养基上生长。2)操作步骤构建诱饵融合基因（AD）转化相应的酵母菌株在检测平板上筛选构建文库（BD）阳性菌落提取质粒DNA，转化大肠杆菌阳性克隆的进一步鉴定,酵母双杂交系统的优点与缺点,优点快速获得相互作用蛋白的基因只需单一步骤的质粒构建在体内鉴定蛋白的相互作用高度敏感-弱小的，暂时的相互作用也能鉴定能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号缺点首先，它并非对所有蛋白质适用；其次，假阳性的发生较为繁多；再次，双杂交鉴定过程中要经过两次转化，而且，酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。最后，在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型。,酵母双杂交系统的应用,酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白质在体研究体系，双杂交系统主要应用于：1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMARKERSYSTEM3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-12、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用。例：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将黄烷酮醇还原酶DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。,3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）例如：HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。,酵母双杂交系统方法的优化,(1)酵母接合型的引入:Bendixenetal通过酵母接合型的引用，避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。(2)诱饵表达载体:常用的有二种，酵母细胞的GA