第二篇　病毒学 第二十四章 病毒感染的检查方法与防治原则

,作者:吴兴安，王芳,单位:中国人民解放军空军军医大学,第二十四章,病毒感染的检查方法与防治原则diagnosis、preventionandtreatmentofviralinfection,第一节病毒感染的检查方法,第二节病毒感染的特异性预防,第三节病毒感染的治疗,重点难点,1.标本的采集与送检的基本原则；2.病毒鉴定的常用方法和鉴定指标。,病毒感染的血清学诊断和快速诊断方法。,病毒感染的防治原则。,病毒感染的检查方法diagnosisofviralinfection,第一节,1.采急性期标本,2.抗生素处理易污染标本,医学微生物学（第9版）,一、标本的采集与送检,3.低温保存，尽快送检,4.血清学诊断采双份血清（发病初期、病后23周）,1.动物接种,医学微生物学（第9版）,二、病毒的分离与鉴定,（一）病毒的分离培养,（1）应用：无敏感细胞培养的病毒（2）优点：结果易观察，可建立动物模型（3）缺点：要有饲养条件，费用高，可能有潜伏病毒，对许多人类病毒不敏感,2.鸡胚培养,医学微生物学（第9版）,（一）病毒的分离培养,（1）孵化914天的鸡胚（2）优点：对多种病毒敏感，条件易控制，操作简单，成本较低（3）缺点：无病毒增殖指标；有些病毒可致鸡胚死亡,二、病毒的分离与鉴定,3.细胞培养,医学微生物学（第9版）,（一）病毒的分离培养,（1）根据细胞生长方式分为：单层细胞培养和悬浮细胞培养（2）根据细胞的来源、染色体特征及传代次数分为原代细胞二倍体细胞传代细胞系,二、病毒的分离与鉴定,医学微生物学（第9版）,原代细胞（primarycell）,来源于动物、鸡胚、引产的人胚组织,对多种病毒敏感来源困难,获取成本高可携带潜伏病毒,医学微生物学（第9版）,二倍体细胞（diploidcell）,对多种病毒敏感不带病毒，无致癌潜能可用于病毒疫苗生产,指在体外分裂50100代后仍保持2倍染色体数目的单层细胞,医学微生物学（第9版）,传代细胞（continuouscell）,对多种病毒敏感繁殖能力高，传代时间长不能用于病毒疫苗生产,由肿瘤细胞或二倍体细胞突变而来,二、病毒的分离与鉴定,（二）病毒的鉴定,医学微生物学（第9版）,1.病毒感染的常用鉴定方法,（1）病毒形态学鉴定电子显微镜：观察病毒的形态和测量病毒的大小,（李凡主编的第8版医学微生物学图28-1，263页）,二、病毒的分离与鉴定,（二）病毒的鉴定,医学微生物学（第9版）,（2）病毒血清学鉴定：用已知特异性抗体对病毒进行种、型和亚型的鉴定,1.病毒感染的常用鉴定方法,二、病毒的分离与鉴定,（二）病毒的鉴定,医学微生物学（第9版）,（3）病毒分子生物学鉴定：对病毒的蛋白抗原和核酸进行检测，方法包括蛋白印迹技术、核酸扩增、核酸杂交、基因芯片和基因测序等,1.病毒感染的常用鉴定方法,二、病毒的分离与鉴定,（二）病毒的鉴定,医学微生物学（第9版）,2.病毒在细胞中增殖的鉴定指标,（1）细胞病变（cytopathy）：部分病毒在敏感细胞内增值时可引起特有的细胞病变，称为致细胞病变作用（cytopathiceffects，CPE），常见的病变有细胞变圆、胞质颗粒增多、聚集、融合坏死、溶解或脱落、形成合胞体、包涵体等,（李凡主编的第8版医学微生物学图24-1，231页）,医学微生物学（第9版）,二、病毒的分离与鉴定,（二）病毒的鉴定,（2）红细胞吸附（hemadsorption，HAd）：带有血凝素的病毒感染细胞后能与脊椎动物红细胞结合,2.病毒在细胞中增殖的鉴定指标,医学微生物学（第9版）,二、病毒的分离与鉴定,（3）病毒干扰作用（viralinterference),某些病毒不引起CPE，但可干扰感染同一细胞的另一病毒增殖，抑制该病毒的CPE譬如风疹病毒和埃可病毒感染同一细胞时，风疹病毒可抑制埃可病毒CPE的发生,（二）病毒的鉴定,2.病毒在细胞中增殖的鉴定指标,二、病毒的分离与鉴定,（4）细胞代谢的改变：细胞增殖后可以导致细胞培养环境的生化改变，如培养液pH发生改变,（二）病毒的鉴定,2.病毒在细胞中增殖的鉴定指标,医学微生物学（第9版）,二、病毒的分离与鉴定,3.病毒的感染性及数量测定,（1）50%组织细胞感染量（TCID50）：测定50%细胞出现CPE的最小病毒量一般以CPE作指标，判断病毒感染性和毒力，用于测定活病毒的数量,（二）病毒的鉴定,医学微生物学（第9版）,二、病毒的分离与鉴定,3.病毒的感染性及数量测定,（2）红细胞凝集试验（血凝实验）：某些病毒具有血凝素，加入动物红细胞可出现凝集，通过测定使红细胞发生凝集的最小病毒量，半定量检测病毒颗粒的含量,（二）病毒的鉴定,医学微生物学（第9版）,二、病毒的分离与鉴定,（3）空斑形成试验（plaqueformingtest）：,原理：将适量病毒接种单层细胞，病毒增殖使感染的细胞脱落，形成肉眼可见的空斑，一个空斑即一个空斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：每个空斑是由一个感染性病毒颗粒形成的。可测定活病毒数量（感染性病毒量的滴度可用PFU/ml表示）,3.病毒的感染性及数量测定,（二）病毒的鉴定,医学微生物学（第9版）,三、病毒感染的诊断,（一）形态学检查,1.电镜和免疫电镜检查：病毒形态和大小,（李凡主编的第8版医学微生物学图27-1，258页）,医学微生物学（第9版）,三、病毒感染的诊断,2.光学显微镜检查：病毒形成的包涵体、合胞体等,（一）形态学检查,（李凡主编的第8版医学微生物学图33-2，314页）,医学微生物学（第9版）,三、病毒感染的诊断,（二）病毒成分检测,1.病毒蛋白抗原检测用已知特异性抗体对病毒抗原进行早期诊断，常用方法酶免疫测定（enzymeimmunoassay，EIA）、免疫荧光测定（immunofluorescenceassay，IFA）、蛋白印迹（Westernblot）,医学微生物学（第9版）,三、病毒感染的诊断,2.病毒核酸检测常用方法有核酸扩增、核酸杂交、基因芯片和基因测序技术等,（二）病毒成分检测,医学微生物学（第9版）,三、病毒感染的诊断,（三）病毒感染的血清学诊断,1.中和试验（neutralizationtest）病毒被特异性抗体（中和抗体）中和而失去感染性的一种试验,医学微生物学（第9版）,三、病毒感染的诊断,2.血凝抑制试验（hemagglutinationinhibitiontest，HI）,病毒特异性抗体鸡红细胞不凝集,红细胞,抗病毒抗体,病毒,病毒被中和、红细胞不凝集,（三）病毒感染的血清学诊断,医学微生物学（第9版）,（吴兴安，王芳提供）,三、病毒感染的诊断,应用：带血凝素病毒感染辅助诊断鉴定病毒型和亚型,病毒特异性抗体鸡红细胞不凝集,（三）病毒感染的血清学诊断,2.血凝抑制试验（hemagglutinationinhibitiontest，HI）,医学微生物学（第9版）,3.特异性IgM抗体检测：辅助诊断急性病毒感染,三、病毒感染的诊断,（三）病毒感染的血清学诊断,医学微生物学（第9版）,病毒感染的特异性预防preventionofviralinfection,第二节,1.灭活疫苗（inactivaedvaccine）通过理化方法将具有毒力的病毒灭活后制成灭活疫苗，这种疫苗失去了感染性但仍保留原病毒的抗原性，常用的有肾综合征出血热疫苗、狂犬病疫苗、甲型肝炎疫苗、流感疫苗等。2.减毒活疫苗（attenuatedvaccine）通过毒力变异或人工选择培养将毒株变为减毒株或无毒株，常用的有脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、乙型脑炎疫苗等。,一、人工主动免疫常用生物制品,医学微生物学（第9版）,3.亚单位疫苗（subunitvaccine）是指用病毒保护性抗原如病毒包膜或衣壳的蛋白亚单位制成的不含有核酸、但能诱发机体产生免疫应答的疫苗。如流感病毒血凝素18个氨基酸肽、型脊髓灰质炎病毒VP1结构蛋白、HBsAg及狂犬病病毒刺突糖蛋白等。4.基因工程疫苗（geneticallyengineeringvaccine）采用DNA重组技术，提取编码病毒保护性抗原基因，将其插入载体，并导入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中表达、纯化后制成的疫苗。例如目前已广泛使用的重组乙肝疫苗（rHBsAg）。,一、人工主动免疫常用生物制品,医学微生物学（第9版）,5.重组载体疫苗（recombinantcarriervaccine）是指将编码病毒抗原的基因转入到载体通常是减毒的病毒或细菌中制成的疫苗，痘苗病毒是常用的载体，已被用于HAV、HBV、HSV、麻疹病毒等重组载体疫苗的研制。6.核酸疫苗（nucleicacidvaccine）目前研究较多的是DNA疫苗，是把编码病毒有效免疫原的基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到宿主体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原刺激机体产生免疫反应。目前已被应用于多种病毒疫苗的研究。,一、人工主动免疫常用生物制品,医学微生物学（第9版）,1.免疫球蛋白主要是从正常人血浆中提取的血清丙种球蛋白（serumgammaglobulin），可用于对某些病毒性疾病（如麻疹、甲型肝炎等）的紧急预防。此外，还有专门针对某一种特定病毒的高效价的特异性免疫球蛋白，如抗狂犬病的免疫球蛋白。2.细胞免疫制剂目前临床用于治疗的细胞因子包括IFN-、IFN-、IFN-、白细胞介素（IL-2、IL-6、IL-12等）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）等。主要用于某些病毒性疾病和肿瘤的治疗。,二、人工被动免疫常用生物制品,医学微生物学（第9版）,病毒感染的治疗treatmentofviralinfection,第三节,1.核苷类药物的化学结构及其抗病毒作用机制,一、抗病毒化学制剂,（人卫社西医图书数据库：黄文林主编的第3版分子病毒学图11-3，194页）,医学微生物学（第9版）,2.非核苷类反转录酶抑制剂：奈韦拉平、吡啶酮3.蛋白酶抑制剂：沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、替拉瑞韦、波普瑞韦、西咪匹韦4.整合酶抑制剂：拉替拉韦、艾维雷韦5.神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦、扎那米韦,一、抗病毒化学制剂,医学微生物学（第9版）,二、干扰素和干扰素诱生剂,1.干扰素（IFN）具有广谱抗病毒作用，毒性小，使用同种IFN无抗原性，主要用于HBV、HCV人类疱疹病毒和乳头瘤病毒等感染的治疗。2.干扰素诱生剂（1）多聚肌苷酸和多聚胞啶酸（polyIC）：为目前最受重视的IFN诱生剂。此干扰素诱生剂制备较易，作用时间较长。但因对机体具有一些毒性，尚未达到普及阶段。（2）甘草甜素：是甘草酸与半胱氨酸、甘氨酸组成的合剂，具有诱生IFN和促进NK细胞活性的作用，可大剂量静脉滴注治疗肝炎。（3）芸芝多糖：是从杂色芸芝担子菌菌丝中提取的葡聚糖，具有诱生IFN、抗病毒、促进免疫功能和抗肿瘤等作用。,医学微生物学（第9版）,三、中草药防治病毒感染,中草药如黄芪、板蓝根、大青叶、贯众、螃蜞菊以及甘草和大蒜提取物等均有抑制病毒的作用，对肠道病毒、呼吸道病毒、虫媒病毒、肝炎病毒感染有一定防治作用，其作用机制尚在研究中。,医学微生物学（第9版）,四、新抗生素类,研究表明，一些来自真菌、放线菌等微生物的抗生素具有抗病毒感染作用。例如真菌产物isochromophilones和及其衍生物能抑制HIV包膜表面gp120与T细胞表面CD4分子结合，阻止病毒吸附和穿入细胞；放线菌产物chloropeptins和也能有效抑制HIVgp120与T细胞CD4分子结合；新霉素B是一种氨基糖苷类抗生素，可作用病毒复制中的调控因子，阻断RNA与蛋白质的结合，从而干扰病毒RNA的复制。,医学微生物学（第9版）,五、治疗性疫苗,是一种以治疗疾病为目的的新型疫苗，主要有DNA疫苗和抗原抗体复合物疫苗。国内外也有人将乙肝疫苗（HBsAg）与其抗体（抗HBs）及其编码基因一起制备治疗性疫苗用于病毒携带者及慢性肝炎的治疗。,医学微生物学（第9版）,六、治疗性抗体,1998年美国FDA批准上市了第一个用于病毒感染性疾病的具有中和活性的人源化鼠单克隆抗体帕利珠单抗（palivizumab），该抗体主要用于严重呼吸道合胞病毒（RSV）肺部感染的高危儿童。它是目前市场上唯一一个被批准上市的治疗病毒性疾病的单抗药物。,医学微生物学（第9版）,七、基因治疗,1.反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide，asON）根据病毒基因组的已知序列，设计能与病毒基因的某段序列互补的寡核苷酸，称为反义寡核苷酸，或反义核酸。反义RNA与病毒靶基因的mRNA互补结合后，可阻断病毒mRNA与核糖体的结合，从而抑制病毒蛋白的翻译。反义DNA可与病毒的关键序列结合，阻抑病毒DNA的复制和RNA的转录。,医学微生物学（第9版）,七、基因治疗,2.干扰RNA（shortinterferingRNA，siRNA）用双股短小RNA抑制相同序列病毒基因的表达，同源mRNA降解，通常双链RNA的长度要小于26个核苷酸。siRNA所引起的基因沉默作用不仅在注射部位的细胞内发生，并可转移到其他部位的组织和细胞，而且可传代，因此这种干扰现象具有放大效应。,医学微生物学（第9版）,七、基因治疗,3.核酶（ribozyme）核酶是继反义RNA之后的又一种抑制病毒靶基因的基因治疗剂。一方面核酶能识别特异的靶RNA序列，并