病毒包装与感染

，病毒包装和感染，基因向量系统，病毒向量系统，非病毒向量系统，腺病毒向量，逆转录病毒向量，线相关病毒向量，简单疱疹病毒向量，伦蒂病毒向量，裸DNA，病毒载体系统，病毒载体的优点，使用细胞自然感染证的传递效率；病毒的宿主具有广泛有效的目标特异性。病毒基因组结构简单，分子背景比较明确，稳定，易变形，容易准备；复杂的组装过程是由细胞完成的。不同的病毒矢量具有不同的表达特性。通过载体变形方式形成复制缺陷结构，安全性高；病毒包装技术经过多年研究，可用于工业化大批量生产的问题，1，安全性：细胞毒性染色体毒性免疫毒性2，目标：转基因转录目标3，有效性：携带外源基因表达水平和持续时间表达的可调节性，要求：1，将外源基因包装为感染性病毒颗粒2，外源基因转移和表达3 常用病毒载体：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体包装的DNA/RNA不包含病毒编码基因，只留下复制和包装所需的净作用组件。 获得的重组病毒粒子有野生型病毒的外壳/外膜和感染，但不表达病毒蛋白，适合腺病毒载体、未涂膜的线性双链DNA病毒、宿主的范围很广、没有分裂或分裂的哺乳动物细胞中高效的瞬间表达。除了一些抗腺病毒感染淋巴瘤细胞外，腺病毒系统在所有哺乳动物细胞中都能高效、即时地表达，是可靠的基因转移平台。感染宿主细胞时，病毒基因组及其包含的外源基因在宿主基因组外自由表达，因此没有插入突变性，安全性高。腺病毒载体可以获得外源基因装载量大，表达速度快，高举重的病毒。可产生108pfu/ml原液，浓缩到1010-1011VP/ml，广泛用于基础研究和基因治疗。通过腺病毒系统包装，将目的基因复制到腺病毒穿梭质粒上，使穿梭质粒线性化，然后与腺病毒质粒一起通过奶油/loxp系统的作用，用特定的大肠杆菌生成同源重组腺病毒颗粒。筛选出的重组腺病毒使用脂质体方法转染了293细胞，并利用具有E1基因的293细胞作为包装细胞，在1 2周内包装E1缺失的腺病毒载体，可以通过配比扩增浓缩病毒颗粒。伦蒂病毒(lentivirus)属于RNA病毒逆转录病毒(Retrovidae)。慢病毒核蛋白前整合复合物具有嗜核特性，病毒基因组通过净发作用元件被携带到细胞核中并表达的基因序列合并到细胞基因组中，慢病毒感染，在有丝分裂细胞中复制，得到持续稳定的高表达。这种特性使慢病毒成为基因治疗的传递载体。伦蒂病毒载体的特性，伦蒂病毒载体将伦蒂病毒改造为骨骼，有效地将目标基因整合到宿主细胞的染色体中，从而感染分裂细胞和无分裂细胞，在原生细胞、干细胞、无分裂细胞等多种细胞类型中实现可重复稳定表达的基因表达工具，典型的伦蒂病毒是人类免疫缺陷病毒(human immunoodeficient virus，human immunoodeficient virus)HIV-1，HIV-1是一种有9个基因的单链RNA病毒。Gag、pol、env3基因编码病毒的基本结构，tat、rev为控制基因，Vif、vpr、vpu、nef4为辅助基因，编码蛋白作为毒性因子参与宿主细胞的识别和感染。gag -组抗原基因，编码核心蛋白基质蛋白，衣壳蛋白，核苷蛋白等pol-polymerase基因，病毒复制所需的酶，如逆转录酶，integrase，protease env-envelope蛋白基因参与HIV-1基因RNA转录的rev -病毒蛋白表达调控因子增加了gag和env基因对结构蛋白表达的Vif -病毒感染因子，在某些细胞因子的协同下，HIV-1在细胞内再生Vpr - R-r蛋白，使HIV在巨噬细胞内增殖vpu - U蛋白，HIV在细胞内增殖，由慢病毒矢量系统组成的第一代慢病毒矢量系统由3质粒系统代表。该系统由包装质粒、涂层质粒和载体质粒三种质粒组成。包装部分HIV-1前病毒基因组消除了包装、逆转和整合所需的连续作用元素，5结束LTR被巨细胞病毒早期启动子取代，3LTR被SV40polyA序列取代。包装托架，表示托架部分与包装组件互补，仅包含包装、反向转换和集成所需的HIV-1净作用组件，以及5 结束LTR和5 结束非翻译区域。包膜表达质粒利用水泡性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)取代了原病毒的env基因。表达载体、包络载体、第三代慢病毒载体系统、第二代慢病毒载体系统、第二代慢病毒载体系统，所有从包质粒中去除HIV的辅助基因(Vif、vpr、vpu和nef)在不影响病毒的逆转度或感染能力的情况下，提高载体的安全性，第三代慢病毒载体系统将把原来的3质粒包装系统替换为4质粒。将Rev基因放在包装质粒上。添加了两个安全功能。一种是构建自身停用的慢病毒载体。也就是说，移除U3区域的3LTR，使托架失去HIV-1增强器和启动子序列。第二种方法是删除tat基因，用异种启动子序列代替，只保留3个基因(gag，pol，rev)，这样更安全。lentivirus包装工艺，将293T细胞转移到60%到70%，用脂质体方法将4个质粒转染细胞。在24小时的体外培养、荧光显微镜下观察，大量细胞表达绿色荧光蛋白，表明质粒转染成功与否。培养48小时后，以超速离心力提取了包含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后，获得了高粘慢病毒浓缩液。另外，进行了感染293T细胞的实验，观察了感染4872小时后约70%的细胞表达绿色荧光蛋白，说明病毒使用了强大的感染力。说明感染的细胞在继代细胞中仍有1、2、3次绿色荧光蛋白的表达，包装的慢病毒具有感染宿主细胞和稳定转换的能力。逆转录病毒载体，即逆转录病毒，是RNA的一种，将RNA逆转为cDNA，然后通过DNA复制/转录/翻译等蛋白酶作用扩增，形成病毒。逆转录病毒的DNA基因组整合到宿主染色体的部位是随机的。逆转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必要步骤。逆转录病毒DNA基因组只有在受感染的细胞分裂期间，才能暴露在宿主细胞的遗传物质中。因此，逆转录病毒只能在分裂的细胞内复制。逆转录病毒载体的特性，优点：广泛的转染，广泛的受体分布，可感染淋巴细胞、肝细胞、肌细胞等多种细胞类型；转入的外源性基因完全稳定于宿主细胞染色体，长期稳定地表达目的基因。对于细胞感染率高的受感染细胞，不会发生病变，在细胞株中长期持续表达外源基因是可能的。限制：只有分裂细胞可以感染。可插入的外源基因很难满足小而大的基因的转移；载体DNA整合人类宿主染色体是随机的，由于随机整合，肿瘤基因激活或肿瘤抑制基因被禁用，有致癌的危险。体内直接基因转移存在病毒逆需求高，病毒直接注射到体内后，受补体影响而消亡等问题。逆转录病毒的亲和力存在差异可分为三类：单抗逆转录病毒(ectropicretrovirus)，感染小鼠、几种小鼠、几种抗逆转录病毒(amphotropicretrovius)、小鼠细胞、逆转录病毒载体包装原理、早期逆转录病毒载体系统由包装细胞系和逆转录病毒表达载体两部分组成。逆转录病毒载体去除了形成病毒粒子所需的gag、pol、env基因，只保留了克隆和包装信号。通过分子克隆技术将目的基因插入这个载体。包装细胞系提供将病毒载体包装成病毒颗粒所需的结构蛋白gag、pol和env蛋白。重组病毒载体引入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补性共同完成病毒组装。这种病毒粒子可能感染其他宿主细胞，这时目的基因进入该细胞，合并到细胞基因组中，插入序列在宿主细胞中表达，并产生目的蛋白。宿主细胞缺少结构基因的逆转录病毒不像包装细胞那样提供结构蛋白，因此宿主细胞内不会产生新的感染性病毒粒子，并在生物产品领域保证该载体的生物安全。第一代包装细胞基因组整合了只缺少包装信号的MLV全病毒基因组，包装的病毒颗粒是短号的。如果将包络蛋白env基因转化为老鼠4070A病毒的双嗜性包络蛋白，则会产生分泌双嗜性病毒的包装细胞。但是这个细胞系包含了只缺少信号的包装结构，在它们和载体之间只需重新组合一次，就能制造出具有复制能力的野生型病毒，从而降低安全性。第二代包装细胞前病毒基因组除了缺少包装信号外，还缺少了5LTR的5 端板顺序，病毒切割捐赠者上游部位进一步缺失，3LTR被SV40的转录终止聚腺苷酸信号取代。这样变形的话，包装细胞和载体系列之间的共同顺序只会存在于gag开始密码子上游53bp旁边的区域。这种包装结构和载体结构至少要经过两个独立的重组才能形成具有复制能力的野生型病毒，从而大大提高基因治疗的安全性。但是如果用早期载体包装，经过长时间的培养，野生型病毒仍然会发生。第三代包装细胞几乎完全消除了由基因载体和包装细胞之间的重组而产生的野生型病毒。包装细胞包含两个互补的逆转录病毒基因组，两者都缺少包装信号，3LTR被SV40中的聚腺苷酸化信号取代。但是，一个包装结构只包含gag和pol基因，另一个结构只包含env基因，这两个基因组合而成的蛋白质包含在载体包装中。这种包装细胞具有更高的安全性。，一般包装细胞系，构成目前常用的逆转录病毒表达系统：包含目标基因的逆转录病毒表达载体；包络蛋白载体；表示Gag/pol的辅助质粒；包装细胞株。表达载体：去除了野生型病毒颗粒形成所需的结构基因。其基本结构和特点如下。(1)5LTR是CMV/MSV异型启动子，缺少序列的3LTR在体内不会发生重组；(2)维持包装信号序列，促进高举重病毒的产生。(3)去除了野生型病毒颗粒形成所需的结构基因，并确保了载体使用的安全性；(4)在目标基因后，用内部核糖体进入基因座，连接抵抗基因，必要时可以选择不同的抵抗力；(5)重组病毒基因组的大小不能超过10kb，如果太大，不能用病毒包装。包络蛋白载体逆转录病毒的宿主范围是由病毒粒子表面的包络蛋白(Env)决定的，病毒基因组不会影响其靶标性，不同的基因组可能包含在同一Env包中，Env源自什么病毒，包装的病毒粒子被称为该病毒的假病毒。逆转录病毒的涂层蛋白质，如10A1、GAP70、4070A，不稳定，与细胞受体的结合部位容易被离心力剪切力或其他机械力破坏。此外，由包膜蛋白质参与的逆转录病毒进入宿主细胞时，需要经过特定的受体配体结合过程，结果决定一种病毒只能感染一种或一种细胞，逆转录病毒表达系统的应用受到限制。包膜蛋白常用的载体是P10A1、pEco、pAmpo和口腔炎疱疹病毒-G蛋白(vesicularstomatitisvirusg，vsv-g)。VSV-G由于宿主范围大，转基因效率高，成为构成逆转录病毒表达系统的最普遍的包络蛋白载体。VSV-G的结构相对简单。与逆转录病毒携带者一起转染包装细胞后，VSV-G蛋白立即表达，病毒通过脂质结合和原生质膜融合调节进入细胞，将重组病毒RNA包装成具有传染性的病毒。包膜蛋白载体pVSV-G，重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和可能感染其他宿主细胞的包装细胞互补作用一起完成了病毒组装，此时目标基因进入该细胞，并整合到细胞基因组中，插入序列在宿主细胞中表达，并产生目的蛋白。包装，反转录病毒包装过程，1)反转录病毒载体制作：将目标基因片段链接到反转录病毒载体；2)细胞准备和病毒包装将293T细胞传递到直径10毫米的培养皿，如果细胞聚合度达到95%以上，则准备转染。转染1小时前将培养皿中的细胞培养液变成不含血清的新鲜DMEM。脂质体转染方法将载体质粒、包膜质粒、包装质粒转染共293T细胞。3)病毒收集转染后48小时内首次收集病毒，使其上升，72h后再次收集。(4)利用amiconultra-15 centrifulfilterdevices(100 knmwl)浓缩病毒。直接用于小鼠细胞感染，或保存在-80 。病毒转染293T细胞荧光检测效果a:体外培养24h时间；时间。b，c :18 72hd，E，F:感染细胞系第一代，第二代，第三代，逆转录病毒感染过程：1)准备转染对象细胞；(2)用含有细胞因子的培养基培养细胞，刺激细胞进入周期，有助于逆转录病毒感染；3)收集细胞，与病毒混合接种。4)培养细胞8-10h，更换不带病毒溶液的培养基；5) 12小时培养后持续第二次感染。(6)第一次病毒感染72h后，采集感染细胞，进行流式分类。病毒反向测量，反向单位：TU/ml，表示每个ml中包含的生物活性病毒粒子的数量。“TU”是“transducingunits”的缩写，汉语是“transducingunits”，意